4. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
4.9 Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự tương tác giữa điện tích của các protein trong mẫu và các nhóm tích điện được cố định trên bề mặt trao đổi. Protein được gắn vào các bề mặt nhờ các liên kết tĩnh điện. Sự bền vững của liên kết được xác định bởi trị số điện tích của protein, mà trị số này lại phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ muối (của dung dịch đệm).
Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein.
Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương.
Cấu tạo của anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose)
Đây là chất trao đổi anion
33 Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm.
Đây là chất trao đổi cation.
Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột.
Để phóng thích những protein này, có thể dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn. Khi đó, phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient.
Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme. Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế. Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau. Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động. Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định hoạt độ của enzyme. Ngoài việc dùng muối NaCl cho các ion Na+ và Cl-, người ta có thể dùng các loại muối khác như KCl, Na3PO4., ta tăng nồng độ ion của pha động (dung dịch rửa giải) (sử dụng gradient , những ion này sẽ thay thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích.
Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion âm, ta thêm muối natri clorua trong dung dịch tách giải bởi vì ion Cl- sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích âm, do đó, những protein mang điện tích âm được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.
Điện tích của protein phụ thuộc vào pH của môi trường:
- Nếu pH lớn hơn pI thì protein tích điện âm - Nếu pH nhỏ hơn pI thì protein tích điện dương - Nếu pH bằng pI thì protein không tích điện.
34 Hình 12 – Sự phụ thuộc của điện tích protein vào pH của dung dịch.
Trong trường hợp enzyme lactase có pI = 4,6 nên nếu pH của dung dịch đệm lớn hơn 4,6 thì enzyme sẽ tích điện âm, ngược lại , enzyme sẽ tích điện dương.
Độ mạnh của tương tác tĩnh điện giữa enzyme và chất trao đổi phụ thuộc vào sự khác biêt giữa pI của enzyme và pH của dung dịch đệm. Vì thế, enzyme lactase có pI bằng 4.6 sẽ được gắn chặt hơn trên cột trao đổi anion nếu enzyme ở trong dung dịch đệm có pH bằng 8 hơn tại pH bằng 7. Để enzyme có thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nó (cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit). pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp.
4.9.1 Mục đích công nghệ:
Khai thác: bằng phương pháp trao đổi ion, ta tách bớt thành phần tạp chất lẫn vào enzyme lactase cần tinh sạch, từ đó ta thu được enzyme lactase tinh khiết hơn , nên mục đích của quá trình trao đổi ion là khai thác.
4.9.2 Các biến đổi của nguyên liệu:
+Vật lý:
Khi ta cho các hạt nhựa trao đổi ion vào trong một dung dịch, chúng sẽ trương nở và gia tăng thể tích. Kèm theo đó là sự solvate hóa xảy ra. Các cấu tử tích điện trong mẫu lỏng sẽ thế chỗ cho các ion trên pha rắn, ngược lại các ion trên pha rắn sẽ dịch chuyển vào mẫu lỏng. Đồng
35 thời các phân tử dung môi và chất tan sẽ dịch chuyển vào bên trong cấu trúc xốp của các hạt nhựa theo nguyên tắc thẩm thấu.
+Hóa học: làm thay đổi thành phần hóa học của mẫu trước và sau xử lý.
+Hóa lý: một số cấu tử không tích điện sẽ bị hấp phụ trong mao dẫn của các hạt nhựa.
+Hóa sinh và sinh học: trao đổi ion không làm biến đổi các quá trình hóa sinh và sinh học.
4.9.3 Các yếu tố ảnh hưởng:
+Nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ thì sự khuếch tán của các cấu tử trong dung dịch tăng lên.
Tuy nhiên, khi nhiệt độ cao có thể gây ra những phản ứng phụ không mong muốn đồng thời làm tăng chi phí năng lượng cho quá trình xử lý. Nhiệt độ quá cao cũng có thể làm vô hoạt enzyme.
+Thời gian: đây là một thông số quan trọng. Nếu thời gian xử lý của mẫu với ionit quá ngắn thì phản ứng trao đổi ion xảy ra không hoàn toàn. Ở đây ta cần chú ý đến tính chất cân bằng của ionit.
4.9.4 Các thông số vận hành :
- Trong quy trình tinh sạch enzyme lactase ở đây, ta vận hành trao đổi ion với các thông số như sau:
- Enzyme lactase thu nhận từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger có pI=4,6. Chọn pH vận hành là pH=7 thì enzyme lactase sẽ tích điện âm.
Khi đó ta thực hiện trao đổi anion.
- Dung dịch đệm sử dụng là đệm phosphate 0,05M có pH=7
- Dung dịch rửa giải là hỗn hợp gồm đệm phosphate 0,05M có pH=7 và dung dịch NaCl 0,5-1M (tỉ lệ thể tích 1:1)
- Nhiệt độ : 250C
- Thời gian: tùy thuộc vào lượng enzym có trong dung dịch.
- Tốc độ pha động: tùy thuộc vào kích thước thiết bị.
- Sau quá trình trao đổi ion:
+Hoạt độ riêng enzym: 40,7 đơn vị hoạt độ/mg protein +Hiệu suất thu hồi: 54,9%
+Độ tinh sạch: 13,57
4.9.5 Thiết bị:
Thiết bị có dạng hình trụ đứng, đáy cầu và được chế tạo bằng thép không rỉ. Phía trên đáy là tấm lưới đỡ. Người ta sẽ cho các hạt nhựa trao đổi ion lên tấm lưới này. Khi cho ionit tiếp xúc với dung dịch, các hạt nhựa sẽ trương nở. Chiều cao của lớp hạt nhựa trong quá trình hoạt động thường dao động từ 1-2m. ở phía dưới tấm lưới người ta thường cho các chất mang dạng hình
36 bào toàn gradient nồng độ trong quá trình hoạt động của thiết bị. Dưới cùng tại cửa thoát là một tấm lưới lọc để ngăn cản sự cuốn trôi các hạt nhựa trao đổi ion ra khỏi thiết bị. Ở phía bên trên các hạt nhựa là ống để phân phối mẫu nguyên liệu. Nguyên liệu sẽ được bơm vào thiết bị qua ống phân phối. Tại đây, nguyên liệu sẽ được phân bố đều trên hình tròn của mặt cắt thân trụ rồi chảy xuống bên dưới. Sản phẩm được lấy ra tại cửa đáy .
Người ta thường sử dụng quá trình trao đổi ion để gắn cấu tử cần thu nhận lên cột ionit.
Như vậy, khi cho mẫu nguyên liệu qua thiết bị trao đổi ion thì sản phậm cần thu nhận sẽ bị giữ lại trên cột. Sau đó, người ta dùng một dung dịch đệm có pH hoặc lực ion thích hợp đế tách sản phẩm ra khỏi cột.dung dịch rửa giải cũng sẻ cho vào cột qua bộ phận phân phối rồi di chuyển theo chiều tử trên xuống dưới.
Tùy theo bản chất của các ion gắn trên hạt nhựa mà người ta sẽ chọn “dung dịch tái sinh”
phù hợp.
1. Tấm lưới đỡ các ionit 6. Cảm biến định mức dịch lỏng trong thiết bị
2. Hạt nhựa trao đổi ion 7. Cửa nạp nguyên liệu cần xử lý
3. Chất mang làm giá đỡ 8. Cửa tháo sản phẩm
4. Lưới lọc 9. Cửa tháo nước vệ sinh
(sử dụngchế độ chảy ngược) 5. Ống phân phối nguyên liệu
Hình 13 – Sơ đồ nguyên lý của thiết bị trao đổi ion
37 Hình 14 – Thiết bị trao đổi ion