4.1. Nguyên liệu:
Phải đạt những chỉ tiêu ban đầu đã qui định ở trên 4.2. Chuẩn bị môi trường:
• Mục đích: chuẩn bị cho các quá trình kế tiếp.
• Các biến đổi chính:
Gia tăng nồng độ của các chất thêm vào, thay đổi pH của môi trường.
• Cách thực hiện:
Cám bột mì cùng với lactose sẽ được bổ sung thêm muối KCl, FeSO4.7H2O theo bảng dưới đây
Bảng 5: Môi trường nuôi cấy Thành phần tỷ lệ(% khối lượng)
Cám bột mì 10%
Lactose 15%
Dịch chiết nấm men 1.50%
KCl 0.50%
FeSO4.7H2O 0.01%
Ngoài ra ta còn bổ sung vào (NH4)2SO4 5g/l, KH2PO4 15g/l. Sau đó cho vào một bình đựng bằng thép không rỉ, hình trụ. Bình này vừa có tác dụng khuấy trộn vừa có tác dụng tiệt trùng bằng nhiệt. Chú ý là lượng nước cho vào trước khi tiệt trùng chỉ bằng 10% lượng nước cần cho vào.
Sau khi đã được thêm vào ta khuấy trộn đều bằng thiết bị cánh khuấy Các thông số:
o Vận tốc cánh khuấy 200 vòng/ phút.
o Thời gian khuấy: tùy lượng môi trường, thông thường từ 15 – 20 phút.
4.3. Tiệt trùng môi trường
• Mục đích: chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy, tạo một môi trường tốt nhất.
• Các biến đổi chính:
o Hóa sinh: Vô hoạt enzyme
o Sinh học: tiêu diệt các loại vi sinh vật
o Hóa học: Thủy phân protein, tạo nguồn N cho nấm sợi sử dụng, các cấu tử mẫn cảm như vitamin có thể bị mất do nhiệt
o Vật lý: Thể tích,khối lượng thay đổi
• Yêu cầu:
Quá trình tiệt trùng càng ít làm mất mát các loại vitamin, khoáng càng tốt. Đây là những yếu tố sinh trưởng cho vi sinh vật. Song cũng cần đảm bảo tiêu diệt được các loại vi sinh vật khác. Tạo điều kiện thuận lợi khi cho nấm sợi vào.
GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 21
• Phương thức thực hiện: cho gia nhiệt bằng hơi nước qua vỏ bình tiệt trùng. Bình tiệt trùng hình trụ, làm bằng thép không rỉ, trên bình có gắn các cảm biến để xác định các thông số nhiệt độ và áp suất. Ta sử dụng hơi nước đã được tiệt trùng để gia nhiệt cho bình lên đến thông số cần đạt.
Hình 15: Bình tiệt trùng Thông số:
o Nhiệt độ : 121 0C o Áp suất : 1.52 bar o Thời gian: 15 phút
Sau quá trình tiệt trùng ta chuyển toàn bộ môi trường qua bình điều nhiệt 4.4. Làm nguội:
• Mục đích: chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy.
• Các biến đổi chính: nhiệt độ môi trường sẽ giảm xuống.
• Yêu cầu: nhiệt độ của môi trường còn khoảng 35 0C, pH của môi trường từ 5 –6.
• Phương pháp: dùng bình điều nhiệt,bình này cũng là bình hình trụ làm bằng thép không rỉ, bên trong có các cánh khuấy, khuấy để đảm bảo sự đồng đều của nhiệt độ. Nếu như cần thiết ta có thể dùng một dòng tác nhân lạnh để trao đổi nhiệt qua vỏ bên ngoài.
4.5. Giống vi sinh vật
• Yêu cầu: đạt được những tiêu chuẩn đã được trình bày ở trên.
• Chọn loài Aspergillus oryaze vì đây là loài không có khả năng sinh độc tố, tốc độ sinh trưởng nhanh và cũng là đối tượng của ngành công nghệ sản xuất enzyme lactase từ vi sinh vật.
4.6. Nhân giống:
GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 22
• Mục đích: chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy.
• Yêu cầu: tạo được giống Vi sinh vật có hoạt lực ổn định, mạnh, số lượng đáp ứng đủ nhu cầu quá trình lên men.
• Phương thức thực hiện:
Ta sẽ tiến hành nhân giống tùy theo yêu cầu của thiết bị ta sẽ xác định được quy mô nhân giống. giả sử cần 100 m3 thể tích lên men.
Từ giống đã phân lập, ta tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch nấm men –nấm sợi để thu nhận sinh khối
4.7. Môi trường nhân giống : môi trường ATCC medium 325
Bảng 6: công thức để pha chế 1 lít môi trường nhân giống
Dịch chiết nấm men 20.0 g
Glucose 20.0 g
Pepton 1.0 g
Agar 20.0 g
Nước cất 1.0 L
Sau đó ta quan đem quan sát thử trên kính hiển vi, đếm số lượng tế bào bằng dụng cụ thích hợp.
Nếu đạt chất lượng, chỉ tiêu thì tiến hành tiếp.
Từ giống gốc, ta hòa vào nước lấy 10ml dung dịch chứa giống cần dùng sau đó tiến hành nuôi cấy trong môi trường như trên thí nghiệm
4.8. Sơ đồ nhân giống:
• Trong phòng thí nghiệm: 10mL– 100mL – 1000mL –10L
• Trong phân xưởng : 10L –100L –1000L – 10 m3– 100 m3.
Lưu ý:
Trong quá trình nhân giống ta nên cho môi trường tối thích để vi sinh vật phát triển ở những cấp nhân giống đầu. Sau đó, nên pha loãng với môi trường sẽ nuôi cấy để lên men nhưng tăng từ từ để vi sinh vật thích nghi dần với môi trường mới. Nên sản phẩm thu được sau này sẽ cao hơn, hoạt tính vi sinh vật mạnh hơn.
Trong quá trình nhân giống cũng như là lên men thì có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
Nhiệt độ:
Hầu hết các loài Vi sinh vật nói chung và nấm sợi nói riêng thì bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ. Nhiệt độ quá thấp có thể gây ức chế nấm sợi, còn nếu quá cao có thể làm chết vi sinh vật, chưa kể đến làm các thành phần môi trường nuôi cấy bị thay đổi.
Oxy:
Đây là một chỉ tiêu quan trọng đối với nấm sợi vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc. do đó cần cung cấp oxy đầy đủ để tổng hợp năng lượng, sinh khối. Nếu thiếu thì gây ức chế hoặc làm chết nấm sợi.
Thời gian nuôi cấy:
GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 23 Đặc biệt quan trọng, nếu để quá lâu hoặc thu quá sớm thì ta sẽ thu sinh khối nấm sợi với số lượng ít hơn có thể. Cũng như các loài vi sinh vật khác, nên thu hoạch cuối giai đoạn phát triển pha log ( vi sinh vật phát triển với tốc độ nhanh nhất (μexpo max)). Có thể kiểm tra bằng cách xác định hàm lượng ATP trong tế bào.
Các thông số:
o Nhiệt độ : 30 – 35 0C
o Hàm lượng oxy: nhỏ nhất là 20% của khí được cho vào nhân giống
o Thời gian nuôi cấy: tùy mỗi cấp nhân giống, thông thường thì thời gian nhân giống của mỗi cấp nhân giống thường dao động trong khoảng từ 24 – 36 h.
4.9. Nuôi cấy:
• Mục đích: khai thác enzyme lactase, tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển.
• Yêu cầu: càng tạo ra nhiều enzyme lactase càng tốt, hoạt lực enzyme càng mạnh càng tốt.
• Các biến đổi chính
o Sinh học: nấm sợi sử dụng các nguồn dinh dưỡng như C,N có sẵn tạo ra một phần năng lượng, tăng sinh khối sau đó,nấm sợi tự tổng hợp ra lactase để thủy phân lactose tạo ra những đường đơn giúp cơ thể hấp thu.
o Vật lý: nhiệt độ tăng, do quá trình sinh tổng hợp tạo ra năng lượng, độ ẩm thay đổi o Hóa lý: thành phần môi trường thay đổi theo độ ẩm, nhiệt độ.
o Hóa học: hàm lượng oxy giảm do sinh vật đã sử dụng và tạo ra CO2 ( tăng nồng độ)
• Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình: cũng như trên là nhiệt độ, oxy, hoạt lực của nấm sợi Nhiệt độ:
Nhiệt độ quá cao, vi sinh vật hoạt động kém hoặc có thể ngừng hoạt động, chưa kể đến là enzyme lactase tạo ra bị vô hoạt. ngược lại, nhiệt độ quá thấp sẽ làm cho vi sinh vật bị ức chế, các quá trình sinh hóa xảy ra chậm, dẫn đến thời gian lên men sẽ bị kéo dài.
Thông thường nên giữ ở nhiệt độ 350C là nhiệt độ tối thích cho loài này.
Oxy:
Đây là loài hiếu khí bắt buộc, vì vậy để tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển thì dùng thiết bị sục khí vào trong thiết bị lên men, có cánh khuấy.
Thông thường thì lượng oxy được cung cấp cũng phải ít nhất là 20% thể tích khí đưa vào bình
Lượng giống cấy:
Quá nhiều hay quá ít đều ảnh hưởng không có lợi. Thông thường, tỷ lệ giống cấy là 107 bào tử/ml.
• Thiết bị:
GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 24 Hình 16: Thiết bị lên men
Thiết bị lên men là một bồn hình trụ làm bằng thép không gỉ, có cánh khấy, có hệ thống đầu dò để kiểm soát nhiệt độ, khi cần thiết ta có thể tiến hành trao đổi nhiệt qua vỏ ống. Ngoài ra còn có hệ thống sục khí vào thiết bị. Không khí được qua bơm rồi qua màng lọc membrane để loại hết những vi sinh vật không mong muốn trước khi sục vào bình. Khi cần thiết, với một nguồn oxy lớn hơn thành phần oxy có trong không khí, ta có thể trộn oxy nguyên chất với không khí với một tỷ lệ xác định.
• Các thông số:
o Nhiệt độ làm việc: 30 oC’.
o pH nhỏ nhất: 4.
o Điều chỉnh tốc độ cánh khuấy: 250 – 600 vòng/phút.
o Hàm lượng oxy trong không khí: ≥20 % (v/v).
o Sục khí 5 L/phút.
o Thời gian nuôi cấy khoảng 160 h. Mỗi 8h ta tiến hành đo hoạt lực của enzyme.
4.10. Nhận xét quá trình
GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 25 Quá trình nuôi cấy sử dụng phương pháp lên men bề sâu, mà trong nuôi cấy thu nhận enzyme lactase nói riêng và trong sản xuất enzyme nói chung thì nên nuôi cấy thu nhận bằng phương pháp lên men bề mặt nên chất lượng enzyme có thể sẽ thấp. Không phải tốn quá nhiều hơi và nhiệt như phương pháp lên men bề mặt vì hơi và nhiệt dễ dàng đi bên trong môi trường lên men, trong khi đó thì lên men bề mặt khó mà hơi và nhiệt có thể đi sâu vào trong cả môi trường.
Tuy nhiên một ưu điểm vượt trội của phương pháp này là dễ dàng cơ giới hóa và tự động hóa cũng như chuyển sang qui mô sản xuất lớn rất dễ dàng và đơn giản.
4.11. Sản phẩm
Sản phẩm là một canh trường sau khi lên men có lẫn enzyme lactase cần thu nhận, do đó, thật ra người ta sẽ làm bước kế tiếp để tách enzyme ra khỏi canh trường. Và lúc đó, người ta sẽ đánh giá thêm chỉ tiêu về hoạt lực của enzyme, độ tinh sạch enzyme…
Còn đối với canh trường sau lên men có một số yêu cầu sau:
• Hàm lượng của enzyme lactse có trong sản phẩm càng cao càng tốt. Thông thường thì hoạt lực của enzyme lactase là 100000 FCC/g
• Lượng cơ chất sót càng ít càng tốt như acid amin, đường… Ngoài ra cũng cần kiểm soát các sản phẩm phụ tạo ra có thể có cả các enzyme khác lẫn vào. Ta hạn chế các chất này đến mức thấp nhất.
• Bảo quản ở điều kiện thích hợp tránh các tác nhân có thể làm vô hoạt enzyme lactase như nhiệt độ không vượt quá 55 0C , pH nên đạt từ 4.5 –5.