CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo và thu màng CVK lên men từ môi trường chuẩn.
- Nạp captopril vào màng CVK.
- Thử nghiệm khả năng giải phóng captopril của màng CVK.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp tạo màng CVK - Tạo màng CVK từ môi trường chuẩn
- Thành phần môi trường lên men tạo màng CVK gồm:
+ Glucozo (20g).
+ Pepton (5g).
+ Na2HPO4 (2,7g).
+ Axit citric (1,15g).
+ Cao nấm men (5g).
+ Nước cất 2 lần (1000ml).
- Quá trình tạo màng CVK được thực hiện ở sơ đồ 2.1 như sau:
Nước cất 2 lần
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, hòa tan hóa chất
Đổ môi trường vào các bình tam
Cho vào hấp ở 121oC, khoảng thời gian là 2h
Đổ giống (10%)
Thêm 2% axit axetic Lên men
Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo màng CVK
- Sau khi nuôi cấy tĩnh 6 - 14 ngày ở 26oC. Thì ta sẽ thu được màng, tùy thuộc vào số ngày mà ta thu được độ dày của màng là khác nhau. Sau khi thu được màng rồi ta đem tinh chế (quy trình tinh chế được thể hiện ở phần dưới).
2.4.2. Quét phổ thuốc Captopril
- Thực hiện trên máy: Máy đo quang phổ UV-2450 (Shimadzu-Nhật Bản).
2.4.3. Phương pháp dựng đường chuẩn
- Trộn mẫu theo tỷ lệ sau và đo bằng máy UV. Ba loại pH sẽ có 3 đường chuẩn (các pH khác nhau đo ở bước sóng khác nhau)
Bảng 2.1: Nồng độ thuốc để xây dựng đường chuẩn
Dd pH (ml) 0ml 0,6ml 1,2ml 1,8ml 2,4ml 2,7ml Dd
thuốc(25mg/90ml)
3ml 2,4ml 1,8ml 1,2ml 0,6ml 0,3ml Sau khi thu được số liệu, dùng excel để lập đường chuẩn.
2.4.4. Chuẩn bị màng CVK
- A. xylinum được nuôi cấy trong môi trường chuẩn Hestrin-Schramm:
2% (wt) glucose, 0,5% (wt) cao nấm men, 0,5% (wt) peptone, 0,27% (wt) disodium phosphate, và 0,15% (wt ) axit citric.
- Sau khi ủ tĩnh cho 6 ~ 14 ngày ở 26 ℃, màng CVK được nhúng vào nước cất trong 2 ngày, và sau đó các màng CV được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình như sơ đồ 2.2:
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước
48 giờ, kiểm tra tạp chất Thu CVK tinh chế
Sơ đồ 2.2: Quy trình tinh chế màng CVK
2.4.5. Chuẩn bị môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline)-PBS 1X - Nghiên cứu sự giải phóng thuốc từ chế phẩm trong 3 môi trường đệm (dung dịch đệm ) với pH tương ứng:
Bảng 2.2: Nồng độ các chất pha môi trường đệm PBS
Dung dịch đệm Hóa chất
pH = 2 KCl (6,57g); 119ml HCl 0,1M; cho nước cất vừa đủ đến 1000ml.
pH = 4.5 KH2PO4 (6,8g); cho nước cất vừa đủ đến 1000ml.
pH = 6.8 Na2PO4 (28,8g); KH2PO4 (11,45g); cho nước cất vừa đủ đến 1000ml.
- Hiệu chỉnh bằng HCl/ NaOH.
+ Nếu pH quá cao thì hiệu chỉnh bằng HCl.
+ Nếu pH quá thấp thì hiệu chỉnh bằng NaOH.
Tách màng CVK thô
Ép loại nước Ngâm trong NaOH 3%
2.4.6. Chế tạo màng CVK nạp captopril
Dựa theo khả năng hấp thụ Captopril của CVK thấy các yếu tố có thể ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ như nồng độ, thời gian,… do đó tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố trên đến khả năng hấp thụ Captopril của màng CVK, khảo sát khoảng giới hạn ảnh hưởng và chọn ra 3 yếu tố có ảnh hưởng nhất đến khả năng hấp thụ của thuốc.
Chuẩn bị 04 bình, mỗi bình chứa 25ml dung dịch Captopril và có nồng độ lần lượt là 25, 50, 75 mg Captopril/ml. Lấy 3,3àl dung dịch trong mỗi bỡnh thí nghiệm (TN) pha loãng bằng dung dịch nước cất với tỷ lệ hợp lý (dùng tỷ lệ như đã xây dựng đường chuẩn), đo mật độ quang (OD1). Dựa vào phương trình đường chuẩn (đã xây dựng) tính lượng Captopril (m1). Lấy 01 màng CVK, cân ghi lại khối lượng ban đầu (mđ) cho vào bình TN đã chuẩn bị như trên.
Đặt 04 bình đã chuẩn bị ở nhiệt độ 800C. Sau 60, 80, 100, 120,… phút lấy 3,3àl dung dịch trong bỡnh TN, pha loóng với tỷ lệ hợp lý (dựng tỷ lệ như đó xây dựng đường chuẩn), đo mật độ quang (OD2, OD3, OD4,…). Dựa vào phương trình đường chuẩn tính lượng Captopril (m2, m3, m4,… mkđ). Lấy mẫu, đo đến khi OD không đổi so với lần đo trước thì dừng TN lại, thu lấy 01 màng CVK trong mỗi bình TN cân được khối lượng cuối (mc). Khối lượng thuốc hấp thụ được tính dựa vào giá trị OD thông qua phương trình đường chuẩn (m1 - mkđ) hoặc dựa vào khối lượng màng CVK trước và sau nạp thuốc (mc - mđ) tìm ra điều kiện nồng độ để màng CVK hấp thụ thuốc cao nhất.
2.4.7. Xác định lượng thuốc giải phóng của màng CVK đã nạp thuốc captopril
- Lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống vận tải được tiến hành:
Cho màng CVK đã hấp thụ captopril có độ dày màng khác nhau vào bình có chứa 900 ml dung dịch đệm.
+ C
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, nhiệt độ là 37 ± 0,5°C.
Sau 0,5h, 1h, 1.5h, 2h, 2.5h, 3h, 3.5h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h. Lấy mẫu và tiến hành xác định lượng thuốc giải phóng.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy giá trị trung bình.
- Việc giải phóng % captopril từ màng CVK được tính theo công thức (1):
R = CtV1
i=n−1 i=1
m
i V2
100% (1) Trong đó: R : Tỉ lệ giải phóng thuốc
Ct: Nồng độ của captopril trong dung dịch ở thời điểm t V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau n: Số lượng mẫu lấy ra từ dịch giải phóng
V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào 2.4.8. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Các số liệu nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Số trung bình cộng được dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05 [14].