CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng và xử lí màng CVK
Môi trường lên men thu màng CVK A. xylinum được nuôi cấy trong môi trường cải biến từ môi trường chuẩn Hestrin – Schramm [18] và được trình bày ở bảng 4:
Bảng 4: Thành phần môi trường lên men tạo màng CVK
Thành phần Môi trường
MT1 (Môi trường chuẩn)
MT2
(Nước vo gạo)
MT 3
(Nước dừa già)
Glucose 20g 20g 20g
Pepton 5g 5g 5g
Disodium photphat
2,7g
KH2PO4 2g 2g
(NH4)2SO4 3g 3g
Cao nấm men 5g Acid citric 1,5g
Acid axetic 2% 2% 2%
Nước cất 2 lần 1000ml
Nước vo gạo 1000ml
Nước dừa già 1000ml
Dịch giống A. xylinum
10% 10% 10%
19
Theo một số kết quả nghiên cứu của một số tác giả thì màng CVK có độ dày từ 0,5 – 1cm phù hợp làm hệ thống hấp thu thuốc. Vì vậy để thu màng CVK có độ dày 0,5– 1cm, chúng tôi tiến hành thu màng từ dịch nuôi cấy tĩnh A. xylinum sau 6 – 14 ngày.
2.3.2. Phương pháp lên men thu màng CVK từ một số môi trường - Chuẩn bị môi trường như bảng 4.
- Dùng máy khuấy từ để khuấy đều môi trường nuôi cấy (môi trường chưa có acid acetic và dịch giống) cho đến khi bão hòa.
- Cho dung dịch vào nồi hấp thanh trùng ở 113ᴼC trong 15 phút để diệt khuẩn và nấm mốc.
- Đặt môi trường tạo màng trong buồng cấy vô trùng, để dưới đèn tím 30 phút. Khi môi trường đã nguội hoặc ở nhiệt độ khoảng 30 - 35ᴼC.
- Sau đó cho dịch giống vào môi trường, thêm vào môi trường 2% acid axetic để hạn chế nấm.
- Cho dung dịch vào hộp đựng và đậy kín lại bằng vải xô. Thực hiện quá trình nuối cấy tĩnh.
- Để khay đựng môi trường tạo màng vào nơi thoáng khí, có nhiệt độ ổn định và không di chuyển dung dịch trong khay từ 6 - 14 ngày để dung dịch lên màng.
-Thu màng CVK: sau khoảng thời gian nuôi cấy tĩnh từ 6 - 14 ngày tiến hành thu màng CVK. Màng CVK này là màng CVK thô, chưa qua quá trình tinh chế.
2.3.3.Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ
-Mục đích: loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy và loại bỏ độc tố của vi khuẩn. Vì vậy, trước khi hấp thu thuốc cần phải xử lý màng, quy trình xử lý màng CVK được thể hiện qua sơ đồ ở hình 2.
20
Hình 2 : Sơ đồ qui trình nuôi cấy thu nhận CVK
- Tách CVK: Trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày trên bề mặt Tách màng CVK thô
Ép loaị nước
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép Hấp
48h,rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
CVK tinh chế
21
môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
- Ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn.
- Ngâm nước: Màng sau khi hấp rửa sạch bằng nước rồi ép màng.
Ngâm nước để trung hòa hết acid trong khoảng 48h ta thu được CVK tinh khiết [9].
Hình 3: Màng sau khi hấp
Hình 4: Màng được xả dưới vòi nước để làm sạch
2.3.4.Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK
22
• Mục đích: nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại được các tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự có mặt của đường glucose trong màng CVK.
• Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của đường D – glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
• Tiến hành:
- Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút.
- Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.3.5.Phương pháp xác định hàm lượng Captopril
Nguyên tắc: sử dụng máy đo quang phổ UV - Vis 2450 để đo các mẫu dung dịch chuẩn (7 mẫu) ở bước sóng 200nm.
Pha thuốc Captopril ở các nồng độ là 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 để đo cường độ quang phổ của các dung dịch đã pha ở bước sóng 200nm trong các dung dịch mẫu chuẩn . Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn Captopril bằng phần mềm Excel 2007.
Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần và đo quang phổ 3 lần, lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn. Kết quả trung bình quang phổ của Captopril ở bước sóng 200nm được thể hiện ở trong bảng 5.
23
Bảng 5: Bảng nồng độ Captopril và giá trị OD 200nm (n=3) Nồng độ C%
(mg/ml)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
0,1 0,113 0,1129 0,1131 0,113±0,01
0,2 0,229 0,231 0,228 0,22±0,0013
0,4 0,457 0,457 0,456 0,457±0,0028
0,6 0,668 0,667 0,669 0,668±0,0028
0,8 0,887 0,888 0,887 0,887±0,0033
1 1,081 1,080 1,082 1,081±0,0012
Hình 5: Đồ thị đường chuẩn Captopril OD 200nm Phương trình đường chuẩn:
24 y=1,073x + 0,0149 (R2 =0,9993) Trong đó: x: nồng độ Captopril (mg/ml).
y: giá trị OD tương ứng.
R2 : hệ số tương quan bình phương.
2.3.6.Tạo màng CVK nạp Captopril
Mục đích: Chế tạo màng CVK nạp Captopril đáp ứng yêu cầu thể chất mềm, mịn, dẻo, độ bền và độ đàn hồi cao, có khả năng điều trị tốt.
Cách tiến hành: [22] Màng CVK có ướt được loại bỏ 30% lượng nước bằng cách sấy ở các nhiệt độ 600oC trong 3h. Cho màng CVK ngâm trong 25ml dung dịch chứa Captopril ở nhiệt độ 80oC trong 2 giờ, cho phép các giải pháp hấp thụ đầy đủ. Sau đó lấy ra và cho vào bao nilon, hấp tiệt trùng ở 1200oC trong 20 phút, hàn bao bì.
2.3.7.Phương pháp xác định lượng Captopril nạp vào màng CVK
Lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK được tiến hành thử nghiệm trên 2 mẫu.
Mẫu 1: Dùng màng CVK có độ dày 0,5cm.
Mẫu 2: Dùng màng CVK có độ dày 1cm.
Cho 2 mẫu màng đã sấy khô vào 2 bình tam giác có chứa sẵn 100ml dung dịch Captopril. Sau đó cho vào máy rung siêu âm để ở nhiệt độ 80⁰C, sau 30 phút, 1giờ, 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ để xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng đến khi giá trị OD không đổi, lặp lại thí nghiệm 3 lần lấy giá trị trung bình để tính toán.
Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được nồng độ Captopril (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng Captopril có trong dung dịch theo công thức số 1 [17]:
26 C% (w/v) = [mct(mg)/Vdd(ml)] x 100% (1)
Trong đó: C% : là nồng độ phần trăm khối lượng - thể tích chỉ số mg :
25 chất tan có trong 100ml dung dịch.
mct : là khối lượng chất tan (mg).
Vdd : là thể tích của dung dịch (ml).
Sau khi tính được lượng thuốc Captopril có trong dung dịch ta tính được khối lượng thuốc Captopril được hấp thụ vào màng CVK theo công thức 2:
mHT = m1 - m2 (2)
Trong đó: mHT là khối lượng thuốc Captopril được hấp thụ vào màng CVK (mg).
m1 là khối lượng thuốc Captopril ban đầu (mg).
m2 là khối lượng thuốc Captopril trong dung dịch sau khi hấp thụ (mg).
Tỉ lệ thuốc được hấp thụ vào màng CVK được tính theo công thức số 3:
EE (%) = (Qt − Qd) / Qt x 100% (3)
Trong đó: EE: phần trăm thuốc được hấp thụ vào màng.
Qt : lượng thuốc lý thuyết.
Qd : lượng thuốc còn lại.
2.3.8. Phương pháp xử lý thống kê
Phân tích thống kê về sự khác biệt trong các tính chất xác định của nhóm được thực hiện qua việc sử dụng Excel với những phân tích một chiều của phương sai và việc xác định khoảng tin cậy. Các kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng “số trung bình ± SD”. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p nhỏ hơn 0,05.
Mỗi công thức được lặp lại ít nhất 3 lần.
Xác định độ dày mỏng, kích thước của màng, lượng thuốc được hấp thụ vào.
2.4. Địa điểm tiến hành nghiên cứu
Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
26