Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Tạo màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già
A. xylinum được nuôi cấy trong môi trường cải biến từ môi trường chuẩn Hestrin- Schamm bằng cách thay cao nấm men bằng nước dừa già được trình bày ở bảng sau:
Bảng 2.3. Thành phần môi trường lên men tạo màng CVK
Thành phần Môi trường lên men
Glucose 20g
Pepton 10g
Diamoni photphat 0,3g
Amoni sulfat 0,5g
Nước dừa già 1.000ml
Hấp khử trùng ở 113oC trong 15 phút sau đó khử trùng bằng tia UV trong 30 phút để nguội môi trường rồi bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, nuôi cấy tĩnh trong 6 ngày ở 26ºC thu được sản phẩm màng CVK thô [14]. Sau khi ủ tĩnh trong 6 - 14 ngày ở 26o C, màng CVK được nhúng vào nước cất và sau đó màng CVK được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình được thể hiện ở sơ đồ hình 2.3.
20
Hình 2.3. Sơ đồ tinh chế màng CVK.
- Sau khi thu được màng nuôi cấy ta ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn vì trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn. Pha dung dịch 12g NaOH/ 1000ml nước cất để ngâm và hấp khử trùng màng. Hấp khoảng 2 giờ sau đó để nguội rồi xả nước cho tới khi màng đạt độ tinh khiết. Nếu màng chưa đạt độ tinh khiết có thể mang hấp lần 2.
- Ngâm nước: màng sau khi hấp khử trùng bằng máy hấp khử trùng rửa nước rồi ép màng. Ngâm nước đến trung hòa hết acid thời gian khoảng 48 giờ ta thu được CVK tinh khiết.
3.2. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK
- Mục đích: nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại được các tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đường glucose trong màng CVK.
- Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của đường D-glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
- Tiến hành:
Tách màng CVK thô
Ngâm trong NaOH 3%
Ngâm trong nước
Thu CVK tinh chế
Ép loại nước
2h, hấp khử trùng
48h, rửa và ép
21
+ Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
+ Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D-glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 phút.
+ Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
3.3. Phương pháp xác định quang phổ hấp thụ của thuốc
Pha loãng thuốc Ranitidine: cân 0,015g Ran pha với 90ml dung môi HCl 0,1N vào bình tam giác 100ml sau đó cho vào máy dung siêu âm để thuốc và dung môi hoà tan vào nhau. Đo quang phổ hấp thụ của thuốc bằng máy đo quang phổ UV- Vis 2450, quét phổ dung dịch Ran trong khoảng bước sóng từ 200 đến 600, lựa chọn bước sóng tại đó ranitidine đạt cực đại (λmax) hấp thụ.
3.4. Phương pháp dựng đường chuẩn
Pha dung dịch Ranitidine ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 10mg/ml;
30mg/ml; 60mg/ml; 90mg/ml; 120mg/ml và 150mg/ml. Sử dụng dung môi là HCl 0,1N. Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo OD của các dung dịch đã pha như trên ở bước sóng hấp thu cực đại (λmax). Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc ranitidine để xây dựng đường chuẩn của thuốc. Ghi kết quả thu được và dựng đường chuẩn của mẫu biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ Ran.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng:
y = ax + b với R2 là hệ số tương quan Trong đó:
y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax x: nồng độ của dung dịch
22
3.5. Phương pháp xác định lượng Ran nạp vào màng CVK
- Sử dụng màng CVK được tạo ra từ nước dừa già có kích thước d1,5cm và độ dày 0,5cm; 1cm đều nhau, đem hấp thụ theo các thông số thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa.
- Sau khoảng thời gian hấp thụ tối đa tiến hành rút mẫu ra đo quang phổ bằng máy UV – 2450 để xác định lượng thuốc còn lại trong dung dịch [13, 14] tại thời điểm lấy mẫu, từ đó xác định được nồng độ thuốc, xác định khối lượng thuốc còn trong dung dịch m2 lượng thuốc hấp thụ vào các màng CVK theo công thức 1.
mht = m1 – m2 (mg) (1) Trong đó:
mht: khối lượng thuốc đã được hấp thu vào màng;
m1: khối lượng thuốc ban đầu trong dung dịch;
m2: khối lượng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất định màng hấp thu thuốc.
- Sau khoảng thời gian 1h, 2h lấy màng CVK ra xác định lượng thuốc được hấp thụ qua màng.
Dùng máy đo quang phổ UV - 2450 xác định lượng Ranitidine trong CVK đã nạp thuốc.
Hiệu suất nạp thuốc vào màng CVK được tính theo công thức 2 [9]:
EE (%) =mht/m1 x 100% (2) Trong đó:
EE: Phần trăm thuốc nạp vào màng (%)
Cho màng CVK vào 50ml dung dịch Ranitidine 150mg (dung môi là HCl 0.1N) ở các trường hợp được thể hiện như bảng 2.3.
23
Bảng 2.3: Các trường hợp thí nghiệm đo độ hấp thụ của màng CVK Số lượng Độ dày
(cm) Điều kiện nạp thuốc của màng
2 0.5 - Loại bớt nước
- Lắc ở 100 vòng/phút - Nhiệt độ 37oC
2 1
3.6. Phương pháp xử lý thống kê
Phân tích thống kê về sự khác biệt trong các tính chất xác định của nhóm được thực hiện qua việc sử dụng Excel với những phân tích một chiều của phương sai và việc xác định khoảng tin cậy. Các kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng “số trung bình ± SD”. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị P nhỏ hơn 0,05. Mỗi công thức được lặp lại ít nhất 3 lần.
Sử dụng phần mềm DDsolver để xử lý số liệu, phần mềm Origin giúp xử lý hình ảnh và sơ đồ.
Xác định độ dày mỏng, kích thước của màng, độ hấp thụ thuốc vào màng.