Chương 2. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu
4. Phương pháp nghiên cứu
Tạo màng CVK có cải tiến từ môi trường chuẩn Hestrin - Schramm [24] bằng cách thay cao nấm men bằng nước vo gạo như được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK
Thành phần Hàm lượng
Đường glucozo 30g
Pepton 10g
(NH4)2HPO4 0.3g
(NH4)2SO4 0.5g
Acid acetic 2%
Nước vo gạo 1000ml
Dịch giống A. xylium 10%
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường như bảng 4.1.
- Bước 2: Hấp khử trùng môi trường đó ở 113oC trong 15 phút.
- Bước 3: Lấy môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để nguội môi trường.
16
- Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 4 - 14 ngày ở 26oC.
- Bước 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
- Sau khi ủ tĩnh cho 4 ~ 14 ngày ở 260, màng CVK được nhúng vào nước cất trong 2 ngày, và sau đó các màng CVK được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình được trình bày trong hình 4.1 dưới đây:
Hình 2.1. Quy trình tinh chế màng CVK
- Tách CVK: Trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
Tách màng CVK thô
Ngâm trong NaOH 3%
Ngâm trong HCl 3%
Ngâm trong nước
Thu CV tinh chế
Ép loại nước
48 giờ, rửa và ép
48 giờ, rửa và ép
48 giờ, kiểm tra tạp chất
17
- Ngâm NaOH: Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn.
- Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước rồi ép màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
- Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với HCl rửa nước rồi ép màng. Ngâm nước đến trung hòa hết acid thời gian khoảng 48 giờ ta thu được CVK tinh khiết.
4.2 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK
Mục đích: Nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại được các tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đường glucose trong màng CVK.
Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành: - Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D - glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 phút.
- Quan sát kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
4.3 Đo bề dày màng CVK
Bề dày màng CVK được xác định bằng thước kẹp panme. Ta đo ở nhiều vị trí khác nhau. Sau đó xác định được bề dày bằng cách tính toán các lần đo.
4.4. Xây dựng đường chuẩn Diclofenac
Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ của thuốc Diclofenac.
18
Chuẩn bị mẫu chuẩn với nồng độ 0.25g/ml. Sử dụng dung môi là dung dịch nước cất. Đo UV ở bước sóng 278nm (bước sóng hấp thụ cực đại của diclofenac).
Ghi kết quả thu được và dựng đường chuẩn của mẫu.
4.5 Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thu vào màng CVK - Cắt các màng CVK có hình tròn, đường kính 0,5cm với độ dày (0,5 cm và 1 cm) tương đối đều nhau.
+ Mẫu 1: Màng CVK có độ dày 0,5 cm không sấy.
+ Mẫu 2: Màng CVK có độ dày 0,5 cm ép loại bớt nước.
+ Mẫu 3: Màng CVK có độ dày 1 cm không sấy.
+ Mẫu 4: Màng CVK có độ dày 1 cm ép loại bớt nước.
- Cho 4 mẫu màng CVK vào 4 bình tam giác có chứa sẵn 100 ml dung dịch thuốc CM 25%. Sau đó cho vào máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút, sau 30 phút, 1 giờ, 1.5 giờ, 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ bằng máy UV - 2450 để xác định lượng thuốc còn lại trong dung dịch tại thời điểm lấy mẫu.
Thực hiện đo 3 lần, lấy giá trị OD trung bình để tính toán. Lấy giá trị OD (y) trung bình thay vào phương trình đường chuẩn (1), được nồng độ CM tương ứng.
Từ nồng độ CM tính được khối lượng CM còn lại trong 100 ml dung dịch methanol pha với 25 mg thuốc CM .
Khối lượng CM hấp thụ được vào màng được xác định theo công thức:
mht = mtr - ms (2) Trong đó:
mht: khối lượng thuốc CM đã được hấp thụ vào màng (mg)
mtr: khối lượng thuốc CM ban đầu trong dung dịch (20 mg) ms:
khối lượng thuốc CM còn lại trong 100 ml dung dịch HCl 0,1N pha với 20 mg thuốc CM (mg)
19
Hiệu suất thuốc hấp thụ vào màng CVK được tính theo công thức [17].
EE (%) = Qt-Qd/ Qt*100% (3) Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào màng (%)
𝑄t: Là lượng thuốc lí thuyết (mg) 𝑄𝑑: Là lượng thuốc còn lại (mg) 4.6. Phương pháp xử lý thống kê
Các số liệu được phân tích xử lý thông qua phần mềm Excel 2010 và được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn [24].
Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của hai mẫu bằng cách sử dụng hàm: t - Test: Two Sample Assuming Unequal Variences, t - Test: Two Sample Assuming Equal Variences với ý nghĩa α = 0,05 những khác biệt được coi là ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.