4. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Thí ghiệm 1: Tạ m g BC từ m i ƣờng chuẩn.
- Thí ghiệm 2: Xử v i m ộ tinh khiết củ m g BC.
- Thí ghiệm 3: D g ƣờng chuẩn diclofenac.
- Thí ghiệm 4: Ch m g ạp thuốc Diclofenac trong khoảng 2h.
- Thí ghiệm 3: Nghiê ứu so khả ă g h p thụ v m g bằng một số phươ g ph p ở m i ường chuẩn.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men và chế tạo hệ mạng lưới BC.
2.2.2.1.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men
Đ i 1000m ƣ bổ g 20g x h g hời gi 10 - 15 phú . S ọ y ị h ổ v v b h hủy i h ạ h hêm 100g ƣờ g h y ề g ội. S h ả g 7 – 10 g y ở hiệ ộ 30oC h ƣợ ị h ƣờ g ê me ( hứ vi h ẩ Acetobacter: Acetobacter xylimun, Acetobacter ketogenum,... ) [17,21] v miế g hạ h ổi ê ê bề mặ . 2.2.2.1.2. Chế tạo hệ mạng lưới BC.
- Lên men thu màng BC từ một số môi trường:
Tạ m g e e vi h ẩn (BC) ải tiến từ m i ƣờng chuẩn Hestrin - S h mm ƣợ h b y g bảng 2.3
MT: m i ƣờng chuẩn
Bước 1: Chuẩn bị m i ƣờng [18, 2, 5, 10, 3].
Bảng 2.3. Thành phần của các môi trường lên men thu màng BC Th h phần M i ƣờng chuẩn
Glucose 20g
Pepton 5g
Dinatri phosphat (khan) (Na2HPO4) 2,7g
Acid citric 1,15g
Cao n m men 5g
Nƣ c c t 2 lần 1000ml
Bước 2: H p khử ù g m i ƣờng ở 1130C g 15 phú .
Bước 3: L y m i ƣờng ra khử ù g bằng tia UV g 15 phú ồi nguội m i ƣờng.
Bước 4: Bổ sung 10% dịch giố g v 2% i e i ắ ều tay cho giố g phâ bố ều trong dung dịch.
Bước 5: Chuy n dịch sang dụng cụ i y he í h hƣ ghiê ứu, ù g gạ v ù g bịt miệng dụng cụ ặ ĩ h trong khoảng 4 – 14 g y ở 280C.
Bước 6: Th m g BC h ửa sạ h hú g ƣ i vòi ƣ c.
2.2.2.2. Xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc, đánh giá độ tinh khiết của màng BC
2.2.2.2.1. Xử lý màng BC trước khi hấp thụ thuốc
Mụ í h: L ại b ƣợ ạp ch t g m i ƣờ g i y ồng thời ph hủy v g hò ộc tố của vi khuẩn.
Phươ g ph p: T g i y ĩ h BC tạ h h m g y ở mặ m i ƣờ g i y ép m g ại b m i ƣờng.
+ T g m g hứa mộ ƣợng l n vi khuẩ v v y h p m g g NaOH n g 3%, nhiệ ộ 1130C trong thời gi 15 phú bằng nồi h p khử ù g HV-110/HIRAIAMA ph vỡ h h ế b vi h ẩ v giải ph g ội ộc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ.
+ Sau khi ngâm N OH v m g ặ ƣ i vòi ƣ c chảy ế hi m g trắng trong. Thử quỳ ím i m m i ƣờng bề mặ m g BC cầ ạ g í h h ƣợc BC tinh khiết [10, 3].
2.2.2.2.2. Đánh giá độ tinh khiết của màng BC.
Mụ í h: Nhằm ảm bả m g BC sau khi xử ại ƣợ ạp ch h gây ộc hại. Ch ƣợc khả p ei ủa vi khuẩn.
*Tìm sự hiện diện của protein trong màng BC tinh chế
Ng yê ắ : Đị h í h p ei ò ại g m g bằ g phả ứ g ạ ế ủ ủ p ei v i i iclor acetic.
Tiế h h: M g BC tinh chế ƣợc cắt nh h v 50m ƣ c c t, lắc kỹ v i m y g iê âm g 10 phú . Dù g g ịch acid triclor acetic 1%
ph hiện s hiện diện của protein trong dịch chiế m g. M u chứ g âm ƣ c c v m u chứ g ƣơ g g ịch pepton 1% (pep ử dụ g i y vi khuẩn). Phản ứ g ƣơ g í h hi h ết tủ ụ . S h v i m u chứ g âm h g hứa protein [23, 7].
M g BC i h hế ù g ạ m g ạp h ố phải ạ ƣợ h g í h h :
+ Cảm : mềm mại ẻ i m g hả ă g p v í h he phủ ố .
2.2.2.3. Xây dựng đường chuẩn diclofenac.
Ng yê í: Sử dụ g m y UV- 2450 (Shimadru - Nh t Bả ) g phổ h p thụ của diclofenac ở ồ g ộ h h v i bƣ g 278 m
Th c hiện: Chuẩn bị m u chuẩn diclofenac v i ồ g ộ lầ ƣợt : 10% 20% 40% 60% 80% 100% g g m i Methanol. M u trắ g g m i hò i fe (Me h ). D g ồ thị ƣờng chuẩ v p phươ g h h ẩn diclofenac bằng phần mềm Ex e 2010 [8]. Đ kết quả ộ hí h x iế h h ph g ịch chuẩn 3 lầ v g phổ 3 lần l y gi ị g b h d g ƣờng chuẩn.
2.2.2.4. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC. Tính hiệu suất Lƣợng thuốc diclofenac h p thụ v m g e e vi h ẩ ƣợc tiến h h hử nghiệm ê 4 m m i ƣờng chuẩn.
- M 1: Dù g m g e e vi h ẩ ộ y 0 5 m.
- M 2: Dù g m g e e vi h ẩ ộ y 0 5 m ép ại ƣ c 50%.
- M 3: Dù g m g e e vi h ẩ ộ y 1 m.
- M 4: Dù g m g e e vi h ẩ ộ y 1 m ép ại ƣ c 50%.
Ch 12 m g v 12 b h m gi hứa 25mg thuố i fe v 100ml dung dị h Me h ƣợc khu y . Ch b h v m y ắc v i chế ộ lắ 150 vò g/phú . S h ng khoảng thời gi 30 phú 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ tiế h h ú m g phổ bằ g m y UV - 2450 x ịnh ƣợng thuố ò ại trong dung dịch tại thời i m l y m u, từ x ịnh ƣợng thuốc h p thụ v m g ế gi ị OD h g ổi hoặ h y ổi h g g , lặp lại hí ghiệm 3 lầ l y gi ị g b h í h .
L y gi ị OD thụ ượ h y v phươ g h ường chuẩ ược nồ g ộ diclofenac (C%) trong dung dịch, từ í h ƣợc khối ƣợng i fe g g ị h he g hức:
(1) T g :
C % ồ g ộ phầ ăm hối ƣợng-th í h h số mg ch trong 100ml dung dịch.
mct hối ƣợng ch t tan trong dung dịch (mg).
mdd hay Vdd h í h ủa dung dịch (ml).
Khối ƣợng diclofenac h p thụ ƣợ v m g ƣợ x ịnh he g thức
mht = mtr - ms (2) T g :
mht: L hối ƣợ g i fe ƣợc h p thụ v m g BC (mg).
mtr: L hối ƣợng diclofenac trong dung dị h b ầu (mg).
ms: L hối ƣợ g i fe ò ại trong 100 ml dung dịch diclofenac 25% (mg).
T lệ % i fe ƣợc h p thụ v m g e e vi h ẩ ƣợ í h he g hức:
EE (%) =
(3) T g :
EE: L phầ ăm hụố ƣợc h p thụ v m g (%).
Qt: L ƣợng thuố hụyết (mg).
Qd: L ƣợng thuố ò ại (mg).
2.2.2.5. Xử lý thống kê
C ố liệ ƣợ phâ í h xử h g phần mềm Ex e 2010 v ƣợc bi u diễ ƣ i dạng số trung b h ± ộ lệch chuẩn. Ki m ịnh giả thiết về gi ị g b h ủa hai m u bằ g h ử dụng test thố g ê. Nh ng h biệ ƣợ i ghĩ hố g ê hi gi ị p < 0,05.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum
3.1.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men
Đ i 1000m ƣ bổ g 20g x h g hời gi 10 - 15 phú . S ọ y ị h ổ v v b h hủy i h ạ h hêm 100g ƣờ g h y ề g ội. S h ả g 7 – 10 g y ở hiệ ộ 30oC h ƣợ ị h ƣờ g ê me ( hứ vi h ẩ Acetobacter: Acetobacter xylimun, Acetobacter ketogenum,... ) [17, 21] v miế g hạ h ổi ê ê bề mặ . Dị h ƣờ g ê me 7-10 g y ƣợ h hiệ ở h h 3.1
Hình 3.1. D ch trà đường lên men sau 7-10 ngày
3.1.2. Tạo màng BC
S hi h v m i ƣờ g vi h ẩ A. xylinum ẽ ử ụ g h i h ƣỡ g g m i ƣờ g ổ g hợp e e. S 1 ầ m g BC bắ ầ h h h h ê bề mặ m i ƣờ g y ê ầ v ừ g ại ại 1 hời i m h ị h. Độ y ủ m g ẽ phụ h ộ v hời gi i y. M g BC ƣợ i y g m i ƣờ g h ẩ h hiệ ở h h 3.2
Hình 3.2. Màng BC được nuôi trong môi trường chuẩn