CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng
Kiểm tra xem có sự có mặt của đường glucose trong màng CVK.
2.2.3.2. Nguyên tắc
Dùng thuốc thử Fehling để phát hiện sự có mặt của đường D – glucose, nếu có thì sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
18 2.2.3.3. Tiến hành
Dịch thử của màng CVK các loại sau hi đã xử lý hóa học. Mẫu đối chứng là nước cất và dung dịch D – glucose.
Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15 phút.
Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.2.4. Phương pháp d ng đường chuẩn
- Pha thuốc Diclofenac ở các nồng độ 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%
- Sử dụng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của các dung dịch mẫu chứa thuốc Diclofenac ở bước sóng 276nm, 278nm, 281nm.
- Để xây dựng đường chuẩn của thuốcta tiến hành đo 3 lần rồi lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Diclofenac.
- Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau thể hiện ở bảng 2.2:
B 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 276nm
STT Nồng độ (mg/ml)
Giá trị OD 276nm (n = 3) Giá trị trung bình
Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 10 0,105 0,108 0,108 0,107 ± 0,001
2 20 0,213 0,214 0,215 0,214 ± 0,001
3 40 0,426 0,42 0,444 0,43 ± 0,008
4 60 0,643 0,638 0,645 0,642 ± 0,003
5 80 0,85 0,86 0,87 0,86 ± 0,006
6 100 1,06 1,075 1,075 1,07 ± 0,006
19
Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm Excel 2010, ết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.3.
Nồng độ dung dịch Diclofenac (mg/ml)
Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm
B 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm
STT Nồng độ (mg/ml)
Giá trị OD 278nm (n = 3) Giá trị trung bình
Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 10 0,116 0,116 0,119 0,117 ± 0,013
2 20 0,21 0,25 0,23 0,23 ± 0,013
3 40 0,49 0,46 0,46 0,47 ± 0,013
4 60 0,66 0,76 0,68 0,7 ± 0,04
5 80 0,95 0,94 0,96 0,94 ± 0,006
6 100 1,169 1,173 1,171 1,171± 0,001
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0 1 2 3 4 5 6 7
Y = 0.199x – 0.1427 R2 = 0.9923
OD 276nm
20
Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm Excel 2010, ết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.4
Nồng độ dung dịch Diclofenac (mg/ml)
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm
Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 281nm
STT Nồng độ (mg/ml)
Giá trị OD 281nm (n = 3) Giá trị trung bình
Lần 1 Lần 2 Lần 3
1 10 0,118 0,123 1,235 0.12 ± 0,002
2 20 0,24 0,28 1,005 0,25 ± 0,014
3 40 0,48 0,49 0,72 0,49 ± 0,001
4 60 0,7 0,8 0,5 0,74 ± 0,004
5 80 0,985 0,98 0,23 0,99 ± 0,04
6 100 1,233 1,234 0,119 1,234 ± 0,001
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
0 1 2 3 4 5 6 7
Y = 0.218x – 0.1583 R2 = 0.9917
OD 278nm
21
Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm Excel 2010, ết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.5
Nồng độ dung dịch Diclofenac (mg/ml)
Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281nm Ta thu được 3 phương trình đường chuẩn ở 3 bước sóng hác nhau:
+ Tại bước sóng 276nm: Y = -0.2002x + 1.2522 (R2= 9905) (1) + Tại bước sóng 278nm: Y = -0.218x + 1.3677 (R2= 9917) (2) + Tại bước sóng 281nm: Y = -0.2297x + 1.4413 (R2 = 9926) (3) Trong đó: x - nồng độ Diclofenac (mg/ml).
y - giá trị OD tương ứng.
R2 là hệ số tương quan.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
0 2 4 6 8
Y = 0.2297x – 0.1667 R2 = 0.9926
OD 281nm
22 2.2.5. Chế tạo màng CVK nạp Diclofenac
Lƣợng thuốc Diclofenac hấp thụ vào màng CVK đƣợc tiến hành thử nghiệm trên 2 mẫu:
Mẫu 1: Màng CVK có độ dày 0,5cm.
Mẫu 2: Màng CVK có độ dày 1cm.
Màng CVK sau khi tinh chế cho vào sấy hô 50%, sau đó để vào bình tam giác có chứa 100ml dung dịch Diclofenac 20%.
Dùng máy đo quang phổ UV - 2450 để xác định lƣợng Diclofenac đã nạp thuốc [8] [16].
Các mẫu lấy trong khoảng thời gian 1 giờ; 1,5 giờ và 2 giờ ta dùng máy quang phổ UV-Vis để đo giá trị OD của từng mẫu.
Để có độ chính xác caota tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi tính giá trị trung bình.
Ta lấy giá trị OD trung bình đó cho vào phương trình đường chuẩn để tính ra nồng độ của Diclofenac.
Để tính lƣợng thuốc hấp thụ qua màng, áp dụng công thức (2):
mht = mtrước - msau
Trong đó:
mht: Lƣợng thuốc hấp thụ vào màng;
mtrước: Khối lượng thuốc ban đầu;
msau: Khối lƣợng chất tan còn lại trong dung môi Hiệu suất nạp thuốc vào màng:
Trong đó:
EE: phần trăm thuốc nạp vào màng : lƣợng thuốc lí thuyết
23 : lƣợng thuốc còn lại
2.2.6. Chuẩn bị môi trường đệm PBS
Nghiên cứu sự giải phóng thuốc Diclofenac từ chế phẩm trong 3 môi trường (dung dịch đệm) với pH tương ứng là 2,0; 4,5; 6,8 [1]:
- Dung dịch đệm pH = 2,0: Hòa tan 6,57g aliclorid trong nước, thêm 119ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1.000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng HCl hoặc NaOH).
- Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphate trong 1.000ml nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH).
- Dung dịch đệm pH = 6,8: Hòa tan 68g dinatri hydrophosphat và 11,45g ali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1.000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).
2.2.7. Xác định lƣợng thuốc giải phóng của màng CVK đã nạp thuốc Diclofenac
- Lƣợng thuốc giải phóng thông qua hệ thống vận tải đƣợc tiến hành:
Cho màng CVK đã hấp thụ Diclofenac có độ dày màng 0,5cm và 1cm ở trạng thái ép và không ép vào bình có chứa 900ml môi trường pH tương ứng bằng 2,0; 4,5 và 6,8.
Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 100 vòng/phút, nhiệt độ là 37 ± 0,5°C.
Sau 0,5h; 1h; 1,5h; 2h; 4h; 6h; 8h; 12h; 24h tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ. Lƣợng mẫu đƣợc rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ sung 5ml dung dịch đệm tương ứng.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần và lấy giá trị trung bình.
- Tỉ lệ giải phóng Diclofenac từ màng CVK đƣợc tính theo công thức (1):
R = 100%
1
1 2
1
m
V C V
C i n
i i
t (1)
24 Trong đó:
R : Tỉ lệ giải phóng thuốc
Ct: Nồng độ của Diclofenac trong dung dịch ở thời điểm t V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau n: Số lƣợng mẫu lấy ra từ dịch giải phóng
V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào 2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Các số liệu và kết quả nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Số trung bình cộng đƣợc dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. Những khác biệt đƣợc coi là có ý ngh a thống kê khi giá trị p < 0,05. Kết quả đƣợc xử lý bởi phần mềm DDSolver và Data analysic.