CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp điều tra.
Thu thập số liệu thống kê qua tài liệu của cơ quan chức năng ở cơ sở và điều tra số liệu tại các hộ chăn nuôi.
2.3.2 Phương pháp lấy mẫu và phân lập vi khuẩn.
2.3.2.1 Mẫu nghiên cứu.
- Mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trong trực tràng của lợn cho tới khi toàn bộ tăm bông thấm ướt phân lợn, lấy ra, cho ngay vào ống nghiệm vô trùng, có nút vặn để tránh sự nhiễm tạp kế phát.
- Mẫu bệnh phẩm: Máu tim, gan, lách, thận... đựng trong túi nilon vô trùng.
2.3.2.2 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn.
Chúng tôi sử dụng phương pháp Kích, mẫu được pha loãng ở nồng độ b, cấy 0,2 ml mẫu cần nghiên cứu vào thạch đặc trong đĩa Petri, rồi đếm số khuẩn lạc (CFU) trên máy đếm.
Số lượng vi sinh vật X trong 1 gam phân được tính theo công thức:
X = 5.a.b
Trong đó: a: là số lượng CFU trung bình trên một đĩa petri b: độ pha loãng mẫu;
Hệ số 5: do cấy 0,2 ml.
2.3.3 Nghiên cứu đặc tính sinh vật học của vi khuẩn.
Nghiên cứu đặc tính sinh vật học của vi khuẩn dựa vào khả năng mọc trên các môi trường nuôi cấy, nhuộm màu Gram, khả năng di động, hình dạng, kích thước, lên men đường theo phương pháp thường quy.
- Xác định hình thái và tính chất bắt màu bằng phương pháp nhuộm Gram.
- Đánh giá tính chất và đặc điểm mọc trên các môi trường lỏng (môi trường nước thịt), môi trường đặc, môi trường thạch máu hoặc trên các môi trường chọn lọc.
- Xác định khả năng di động: dùng môi trường thạch mềm (Motility Test Medium) hoặc theo phương pháp giọt treo.
- Sử dụng môi trường thạch KTA ( Kligler Tron Agar) để xác định:
+ Khả năng lên men đường glucose và sinh axit ở thạch đứng tạo màu vàng.
+ Lên men đường lactose và sinh axit ở thạch nghiêng tạo màu vàng.
+ Lên men sinh hơi làm nứt thạch và đẩy môi trường lên ở phần đáy ống nghiệm.
+ Không sản sinh H2S nên môi trường không có màu đen.
- Trong môi trường EMB (Eosin - Methylen - Blue) vi khuẩn lên men đường lactose, sinh axit, kết hợp với xanh Methylen và Eosin hình thành màu đen tím.
- Phản ứng sinh Indol: dùng môi trường Nutrien Broth có Tryptophan. Nguyên lý của phản ứng là do E.coli có chứa men Tryptophanase phân huỷ Tryptophan. Dùng thuốc thử Kowacs để xác định kết quả, phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu đỏ trên môi trường.
2.3.4 Phương pháp xác định Type kháng nguyên của vi khuẩn.
Phương pháp được tiến hành bằng thực hiện phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Vi khuẩn E.coli có nhiều serotype O khác nhau, do đó
bước quan trọng đầu tiên là xác định được nhóm serotype O, sau đó tiến hành làm các phản ứng ngưng kết với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm cần xác định. Những nguyên liệu cơ bản cho việc định type gồm:
+ Các chủng E. coli cần định type được giữ trên thạch máu + Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá)
* Phương pháp tiến hành:
Nhỏ lên hai đầu lam kính sạch, mỗi đầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E.coli cần xác định trên môi trường thạch máu trộn đều với hai giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (đối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết sẽ xuất hiện sau 2-3 phút. Kết quả dương tính khi xuất hiện các hạt ngưng kết, mức độ được đánh dương tính từ mức 1(+) cho tới 4(+).
- Phản ứng âm tính: khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều không xuất hiện những hạt ngưng kết như bên đối chứng.
- Phản ứng dương tính: khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm hai phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Nếu phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì đánh giá ở mức 4(+), nếu phản ứng diễn ra chậm, sự ngưng kết không nhiều... tuỳ theo khả năng ngưng kết để đánh giá các mức ngưng kết khác.
- Những chủng E. coli cho phản ứng ngưng kết dương tính với kháng huyết thanh nhóm, tiếp tục thực hiện như trên với các kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để định type. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều kháng huyết thanh
đơn giá khác nhau thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số hai, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
2.3.5 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn.
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn E.coli phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (NCCLS) (1999). Phương pháp tiến hành như sau:
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hiton
- Bước 2: Các chủng vi khuẩn E.coli được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C. Lấy 1/2 khuẩn lạc, hòa vào 1,5 ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton.
- Bước 3: Đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxioid (Anh) Code 1332 E lên mặt đĩa thạch.
- Bước 4: Bồi dưỡng đĩa thạch ở 370C/ 18 - 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.