CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng cellulose vi khuẩn từ một số môi trường
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường như trên.
- Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường đó ở 1200C trong 60 phút.
- Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để nguội môi trường.
- Bước 4: Bổ sung 25% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 4 – 10 ngày ở 260C.
- Bước 6: Thu màng cellulose vi khuẩn thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
2.4.2. Phương pháp xử lý màng cellulose vi khuẩn trước khi hấp thụ thuốc Sau khi nuôi cấy tĩnh 4 - 10 ngày ở 26oC, màng cellulose vi khuẩn đƣợc nhúng vào nước cất.
Để kiểm tra xem màng cellulose vi khuẩn đã sạch hay chƣa, ta thử bằng 1-2 giọt Triclo axetat trong dung dịch nước cất 2 lần. Nếu thấy có vẩn trắng, chứng tỏ màng chưa sạch. Tiếp tục xử lí dưới vòi nước chảy nhẹ.
18
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng cellulose vi khuẩn Mục đích: nhằm đảm bảo màng cellulose vi khuẩn sau khi xử lý đã loại được các tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đường glucose trong màng cellulose vi khuẩn.
Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
- Dịch thử của màng cellulose vi khuẩn các loại sau khi đã xử lý hóa học.
- Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D - glucose.
- Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thụốc thử Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 phút.
- Quan sát kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.4.4. Phương pháp dựng đường chuẩn của omeprazole
Nguyên lí: Sử dụng máy UV 2450 đo quang phổ hấp thụ của omeprazole ở các nồng độ khác nhau với bước sóng 275 nm [24].
Thực hiện: Chuẩn bị các mẫu chuẩn omeprazole với các nồng độ lần lƣợt là: 100%, 80%, 60%, 40%, 20%, 10% mg/ml trong dung môi 0,1N NaOH.
Mẫu trắng là dung môi hòa tan omeprazole (0,1N NaOH).
Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn omeprazole bằng phần mềm Excel 2010 [3].
Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần và đo quang phổ 3 lần lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.
Kết quả quang phổ trung bình của omeprazole ở bước sóng 275nm đƣợc trình bày trong bảng 2.2
19
Bảng 2.2: Mật độ quang (OD) của dung dịch Omeprazole ở các nồng độ
STT C% (mg/ml) Gía trị OD 275nm Giá trị trung
bình
Lần1 Lần 2 Lần 3
1 100% 1,21 1,212 1,211 1,21±0,005
2 80% 0,968 0,966 0,967 0,968 ±0,0005
3 60% 0,741 0,741 0,74 0,74±0,02
4 40% 0,514 0,512 0,512 0,513±0,002
5 20% 0,276 0,274 0,273 0,275±0,0015
6 10% 0,053 0,055 0,055 0,054±0,0006
Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn omeprazole bằng phần mềm Excel 2010, kết quả đƣợc đồ thị nhƣ sau:
Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn của omeprazole Phương trình đường chuẩn:
Mật Độ Quang
(OD)
Nồng độ omeprazole (mg/ml)
20 y = 0.231x – 0.1819
Trong đó: x: Nồng độ omeprazole (mg/ml)
y: Giá trị OD tương ứng với nồng độ x R2: Hệ số tương quan bình phương
2.4.5. Phương pháp xác định lượng thuốc omeprazole hấp thụ vào màng cellulose vi khuẩn
Omeprazole được nạp vào vật liệu cellulose bằng phương pháp hấp thụ : vật liệu cellulose vi khuẩn sau khi đƣợc sản xuất và làm sạch.
Sử dụng vật liệu celluose được tạo ra từ nước vo gạo có kích thước đường kính d1,5cm và độ dày 1cm, 0.5cm đều nhau, đem hấp thụ theo các thông số thiết kế thí nghiệm.
Lưu ý : Khi cho màng vào hấp thụ phải loại bỏ 50% nước của màng sau đó mới cho màng vào hấp thụ.
Sau khi tham khảo các nghiên cứu trước đó thì đã xác định được nhiệt độ và chế độ lắc tốt nhất cho màng hấp thụ thuốc Omeprazole.
21
Bảng 2.3 : Các thí nghiệm cần làm để tìm ra điều kiện tối ƣu nhất STT Đường kính
(cm)
Độ dày màng (cm)
Nhiệt độ (oC)
Chế độ lắc (vòng/phút) 1
d = 1,5
1
40 100
2 40 120
3 50 100
4 50 120
5
0,5
40 100
6 40 120
7 50 100
8 50 120
Xác định lƣợng thuốc hấp thụ vào vật liệu: Sau khoảng thời gian xác định rút ra từ dung dịch Omeprazole chứa vật liệu cellulose vi khuẩn nêu trên đo quang phổ bằng máy UV – 2450 đã xác định đƣợc độ dày màng, nhiệt độ, chế độ lắc tốt nhất để thuốc Omeprazole có thể hấp thụ đƣợc, từ đó xác định đƣợc nồng độ thuốc, xác định khối lƣợng thuốc còn trong dung dịch m2 lƣợng thuốc hấp thụ vào các màng cellulose vi khuẩn theo công thức 1.
mht = m1 – m2 (mg) (1) Trong đó: mht: khối lƣợng thuốc đã đƣợc hấp thu vào màng;
m1: khối lƣợng thuốc ban đầu trong dung dịch;
m2: khối lƣợng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất định màng hấp thu thuốc.
Phương trình đường chuẩn nhất định của Omeprazole trong dung môi NaOH 0,1N đo ở bước sóng 275nm:
y=0,231x-0,1819 với hệ số tương quan R2=0,9999;
+ Trong đú : x là nồng độ Omeprazole (àg)
22 y là giá trị OD tương ứng
Hiệu suất thuốc nạp vào màng cellulose vi khuẩn đƣợc tính theo công thức 2.
EE (%) = x 100% (2) Trong đó: EE: Hiệu suất thuốc nạp vào màng (%) Qt: Lƣợng thuốc lí thuyết (mg)
Qd: Lƣợng thuốc còn lại (mg) 2.4.6. Phương pháp xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để tính toán, các số liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn [17].
Kiểm định giả thụyết về giá trị trung bình của hai mẫu bằng cách sử
dụng hàm: t - Test: Two Sample Assuming Unequal Variences trong Excel 2010 với mức ý nghĩa = 0,05. Giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05 [3].
23