CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯƠNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.2. Thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị Nước sản xuất Địa điểm nghiên cứu Nồi hấp khử trùng HV-
110/HIRAIAMA
Nhật Bản Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2
Máy đo quang phổ UV- Vis 2450
Shimadru - Nhật Bản
Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2
Cân phân tích Sartorius - Thụy Sỹ Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2
Buồng cấy vô trùng Haraeus Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2
Tủ sấy, tủ ấm Binder - Đức Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2
22 Dụng cụ:
Bình định mức 10ml, 50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml
Micropipet 20-200àl Erlen 100ml
Becher 50ml, 100ml, 500ml
Thiết bị lên men tạo màng BC kích thước 1,5cm x1cm (khuôn tạo màng d1,5cm), bình tam giác, ống nghiệm và các dụng cụ khác.
2.1.3. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo vật liệu CVK Bảng 2.2 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc
1 Omeprazole Trung Quốc
2 D- Glucose Trung Quốc
3 Axit acetic Việt nam
4 Amoni sulfat Trung Quốc
5 Disodium phosphate Trung Quốc
6 Axit citric Trung Quốc
7 Peptone European Union
8 Natri hidroxit Việt Nam
9 Nước cất 2 lần Viện NCKH&ƯD
Trường ĐHSP Hà Nội 2
10 Ethanol Nhà máy hóa chất Đức Giang
23
Đun sôi 1000ml nước, bổ sung 20g trà xanh để trong thời gian 10 - 15 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào vào bình thủy tinh sạch, thêm 100g đường khuấy đều, để nguội. Sau khoảng 7 – 10 ngày ở nhiệt độ 30oC thu được dịch trà đường lên men (chứa vi khuẩn Acetobacter: Acetobacter xylimun, Acetobacter ketogenum,...) và miếng thạch nổi lên trên bề mặt.
2.2.1.2. Tạo vật liệu CVK
Lên men thu vật liệu CVK từ môi trường nước vo gạo Bước 1: Chuẩn bị môi trường.
Bảng 2.3 Môi trường lên men từ vật liệu CVK
Thành phần Môi trường
Glucose 20g
Pepton 10g
Amoni sulfat 0,5g
Nước vo gạo 1000ml
- Thêm dịch giống vào từng môi trường với lượng như nhau và tối thiểu bằng 10% thể tích môi trường. pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh = 4-6 (pH tốt nhất cho sự phát triển của A. xylinum là 6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác.
Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường ở 1130C trong 15 phút.
Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để nguội môi trường.
24
Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch.
Bước 5: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4 – 14 ngày ở 280C.
Bước 6: Thu màng CVK thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước.
2.2.2. Phương pháp xử lý vật liệu CVK trước khi hấp thụ thuốc 2.2.2.1. Xử lý vật liệu CVK trước khi hấp thụ thuốc
Mục đích: Khi xử lý vật liệu CVK để loại bỏ được các tạp chất trong quá trình làm thí nghiệm cũng như môi trường nuôi cấy để phá hủy và trung hòa các độc tố của vi khuẩn trước khi cho thuốc omeprazole vào hấp thụ.
Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, các sợi cellulose liên kết chặt chẽ với nhau sau một thời gian tạo nên vật liệu CVK với độ dày cần cho thí nghiệm.
+ Vật liệu CVK chứa một lượng lớn vi khuẩn cho vật liệu nên trước khi hấp thụ cần hấp khử trùng bằng NaOH nóng 30%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ.
+ Sau khi hấp với NaOH, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt vật liệu CVK cần đạt là trung tính, ta thu được vật liệu CVK tinh khiết.
2.2.2.2. Xác định pH của vật liệu CVK tinh chế
- Sau khi tinh chế pH của vật liệu CVK phải nằm trong khoảng pH trung tính và được đo pH dịch chiết màng bằng máy đo pH.
25
- Cân và cho vật liệu CVK vào 1 bình nón chứa nước khử khoáng theo tỉ lệ vật liệu CVK và nước là 1:100 (khối lượng/thể tích), đặt bình vào máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ.
- Sau khoảng thời gian 3 giờ lấy một lượng dung dịch chiết và đo pH ở mỗi bình bằng pH kế.
2.2.2.3. Xác định lƣợng vật liệu CVK tạo thành
Vật liệu CVK sau khi được tách ra khỏi môi trường, xử lý bằng các chất hóa học để có thể thu được vật liệu CVK tinh chế.
Vật liệu CVK tinh chế được đặt lên cân sau đó dùng giấy thấm thấm đi 50% hàm lượng nước trong vật liệu CVK và khối lượng vật liệu CVK tạo thành.
2.2.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của vật liệu CVK
Mục đích: Dùng các vật liệu để khảo sát là đường glucose và protein của vi khuẩn để đảm bảo rằng vật liệu CVK đã được loại bỏ các tạp chất cũng như các chất gây độc do vi khuẩn tạo ra.
- Tìm sự hiện diện của glucose trong vật liệu CVK tinh chế Nguyên tắc:
+ Ta pha thuốc thử Fehling để có thể phát hiện ra sự hiện diện của đường D - glucose, nếu có tạp chất hay chất độ hại sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
+ Dịch thử của vật liệu CVK được pha theo công thức có sẵn (40g CuSO4.5H
2O hòa tan trong 1 lít nước cất).
+ Mẫu đối chứng: nước cất và dung dịch D – glucose.
+ Cho 1ml thuốc thử Fehling vào các ống nghiệm có chứa vật liệu CVK sau đó ngâm trong khay nước nóng.
+ Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
26
- Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu CVK tinh chế
Nguyên tắc: Dùng các phản ứng tạo kết tủa của protein với acid triclor acetic để xem có còn protein trong vật liệu CVK hay không.
Tiến hành:
Cho 50ml nước cất vào một cốc đong và cắt nhỏ vật liệu CVK tinh chế cho vào cốc đong có sẵn 50ml nước cất đó đem lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút.
Cho từ từ dung dịch acid triclor acetic 1% vào cốc đong để xem có còn sự xuất hiện của protein trong vật liệu CVK hay không.
Mẫu chứng âm là nước cất.
Mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn).
Sau đó quan sát nếu có kết tủa đục là vẫn còn protein.
Vật liệu CVK tinh chế dùng để tạo màng nạp thuốc phải đạt được những tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng giải phóng thuốc tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô.
2.2.4. Phương pháp xây dựng đường chuẩn Omeprazole 2.2.4.1. Xây dựng đường chuẩn Omeprazole
Phương pháp: Dùng máy quét quang phổ UV-Vis
- Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV-Vis (phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử) phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử.
27
- Chúng tôi sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến. Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm.
- Chúng tôi sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±0,005cm.
- Các cuvet đo được làm sạch và thao tác thận trọng.
- Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của các dung dịch đã pha như trên ở hấp thu cực đại (λmax).
- Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc omeprazole để xây dựng đường chuẩn của thuốc.
- Phương trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ omeprazole và độ hấp thụ.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng:
y = ax+b với R2
Trong đó: y : Độ hấp thu của dung dịch tại λmax
x : Nồng độ của dung dịch R2 : Là hệ số tương quan
2.2.4.2. Xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng CVK
- Omeprazole được nạp vào vật liệu CVK bằng phương pháp hấp thụ:
vật liệu cellulose vi khuẩn sau khi được sản xuất và làm sạch.
- Sử dụng vật liệu CVK được tạo ra từ nước vo gạo có kích thước đường kính 1,5cm và độ dày 1cm, 0,5cm đều nhau, đem hấp thụ theo các thông số thiết kế thí nghiệm.
- Lưu ý : Khi cho màng vào hấp thụ phải loại bỏ 50% nước của màng
28 sau đó mới cho màng vào hấp thụ.
- Sau khi tham khảo các nghiên cứu trước đó thì đã xác định được nhiệt độ và chế độ lắc tốt nhất cho màng hấp thụ thuốc Omeprazole.
29
Bảng 2.4 Các thí nghiệm cần làm để tìm ra điều kiện tối ƣu
STT
Đường kính (cm)
Độ dày màng (cm)
Nhiệt độ (oC)
Chế độ lắc (vòng/phút) 1
d = 1,5
1
40 100
2 40 120
3 50 100
4 50 120
5
0,5
40 100
6 40 120
7 50 100
8 50 120
Xác định lượng thuốc hấp thụ vào vật liệu: Sau khoảng thời gian xác định rút ra từ dung dịch Omeprazole chứa vật liệu cellulose vi khuẩn nêu trên đo quang phổ bằng máy UV – 2450 đã xác định được độ dày màng, nhiệt độ, chế độ lắc tốt nhất để thuốc Omeprazole có thể hấp thụ được, từ đó xác định được nồng độ thuốc, xác định khối lượng thuốc còn trong dung dịch m2 lượng thuốc hấp thụ vào các màng CVK theo công thức 1.
mht = m1 – m2 (mg) (1) Trong đó:
mht: khối lượng thuốc đã được hấp thu vào màng m1: khối lượng thuốc ban đầu trong dung dịch
m2: khối lượng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất định màng hấp thu thuốc
30
Hiệu suất thuốc nạp vào màng cellulose vi khuẩn được tính theo công thức 2.
EE (%) = x 100% (2) Trong đó: EE: Hiệu suất thuốc nạp vào màng (%) Qt: Lượng thuốc lí thuyết (mg)
Qd: Lượng thuốc còn lại (mg) 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
- Số liệu thí nghiệm thu được khi xác định hiệu suất nạp thuốc được phân tích trên phần mềm Microsoft Excel.
- Mỗi thí nghiệm thì làm lặp đi lặp lại 3 lần, các số liệu thống kế được biển diễn bằng trung bình công ± SD.
- Sự khác biệt của giá trị trung bình giữa các công thức được đánh giá nhờ phép so sánh với mức tin cậy 95%.