2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu
- Omeprazole (95%) xuất sứ từ Ân Độ.
- Dung môi là NaOH 0,1M và chất phản ứng khác đƣợc cung cấp từ Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Màng CVK lên men từ môi trường chuẩn (HS).
2.1.2. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu - Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
- Cân kỹ thuật (Sartorius - TE612).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA.
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức) và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.1.3. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK
Đường glucose, peptone, chiết cao nấm men, Disodium phosphate hydro (Na2HPO4), axit citric, NaOH, HCl,… đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị màng CVK 2.2.1.1. Tạo màng CVK thô
Tạo màng CVK từ môi trường HS. Quá trình lên men thu màng CVK thô được thực hiện theo các bước sau: [6], [9].
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1.
15
Bảng 2.1. Thành phần môi trường chuẩn tạo màng CVK
Thành phần Trọng lƣợng
D - glucose 20g
Peptone 5g
Cao nấm men 5g
Dinatri hidrophotphat (khan) (Na2HPO4) 2,7g
Axit citric 1,15g
Nước cất 2 lần 1000ml
- Bước 2: Hấp khử trùng môi trường ở 113oC trong 15 phút.
- Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia cực tím trong 15 phút rồi để nguội môi trường.
- Bước 4: Bổ sung tối thiểu 10% dịch giống và 2% axit acetic, lắc cho giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng bình, ủ tĩnh trong khoảng từ 10 - 13 ngày ở 26oC.
- Bước 6: Thu màng CVK thô.
16 2.2.1.2. Tạo màng CVK tinh khiết
Xử lí màng CVK thô để thu màng CVK tinh khiết theo quy trình hình 2.1.
Hình 2.1. Quy trình tạo màng CVK tinh khiết - Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK. [6].
Kiểm tra sự hiện diện của protein trong màng CVK sau khi tinh chế: Định tính bằng thuốc thử là axit Trichloro axetic (CCl3COOH).
Màng CVK tinh chế đƣợc đục nhỏ bằng khuôn, cho vào 2 ống nghiệm:
Tách màng CVK thô
Rửa bằng nước cất
Bình 1000ml NaOH 0,3M (20 - 30 màng d=1,5cm)
Hấp trong 113o C, 15 phút
CVK tinh khiết
Xả nước, 8 giờ
17
Ống 1(ống đối chứng) chứa màng và 10ml nước cất 2 lần, Ống 2 (ống thí nghiệm) chứa 10ml nước, sau đó nhỏ vài giọt axit Trichloro axetic vào ống 2, sau đó lắc đều. Nếu nước trong ống 2 không bị đục, như ống đối chứng thì màng đã sạch. Ngược lại, nếu bị đục thì màng chưa sạch và tiếp tục xả nước.
2.2.2. Quét phổ hấp thụ của thuốc Omeprazole
Hòa tan 2,0 mg chế phẩm trong dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Đo phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thu được từ bước sóng 200 nm đến 400 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc Omeprazole.
2.2.3. Chế tạo màng CVK nạp thuốc Omeprazole 2.2.3.1. Xây dựng đường chuẩn thuốc Omeprazole
Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ của thuốc Omeprazole. Chuẩn bị mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau: Pha dung dịch Omeprazole ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,1mg/ml; 0,2mg/ml;
0,4mg/ml; 0,6mg/ml; 0,8mg/ml và 1mg/ml. Sử dụng dung môi là NaOH 0,1M.
Đo UV ở bước sóng hấp thụ cực đại của Omeprazole.
2.2.3.2. Nạp Omeprazole vào màng CVK
Cho màng CVK vào 20ml dung dịch Omeprazole 30mg (dung môi NaOH 0,1M) thời gian 2 giờ ở 2 trường hợp thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các trường hợp hấp thụ thuốc Omeprazole Trường hợp Đường kính
màng CVK
Độ dày màng CVK
Điều kiện nạp thuốc của màng
TH1 d= 1,5cm 0,5cm - Lắc 100 vòng/phút
- Nhiệt độ 40oC
d= 1,5cm 1cm
TH2 d= 1,5cm 0,5cm - Lắc 120 vòng/phút
- Nhiệt độ 50oC
d= 1,5cm 1cm
18
* Xác định hàm lượng thuốc Omeprazole được nạp vào màng CVK.
Sau 2h lấy màng CVK ra xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng.
Dùng máy đo quang phổ UV - 2450 xác định lƣợng thuốc Omeprazole trong màng CVK đã nạp thuốc.
Hiệu suất nạp thuốc vào màng CVK đƣợc tính theo công thức (1) [12].
EE (%) = x 100% (1) Trong công thức (1):
EE: Hiệu suất thuốc nạp vào màng (%).
Qt: Lƣợng thuốc lí thuyết (mg).
Qd: Lƣợng thuốc còn lại (mg).
2.2.3.3. Phân tích thống kê
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần để lấy trung bình mẫu và phân tích thống kê số liệu qua phần mềm Excel 2013 để phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy. Tất cả các dữ liệu đƣợc trình bày theo giả định trung bình và độ lệch chuẩn “MEAN ± SD”. [13].
19