CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo
A. xylium được nuôi cấy trong môi trường chuẩn Hestrin - Schramm bằng cách thay cao nấm men bằng nước vo gạo được trình bày như trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy A. xylium
Thành phần Khối lượng
Nước vo gạo 1000 ml
Glucose 20 g
KH2PO4 2 g
(NH4)2SO4 3 g
Pepton 4 g
Acid acetic 5 ml
10% dịch giống A.xylium
Quá trình lên men tạo màng CVK sử dụng quy trình lên men tĩnh: Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các bình lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các bình được đậy bằng vải xô có độ xốp giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men là 28- 30oC.
Nguyên liệu nước vo gạo sau khi lọc loại bỏ cặn và tạp chất sau đó thêm các chất dinh dưỡng cần thiết tạo màng. Hấp tiệt trùng ở 113oC, trong 15 phút.
Để nguội rồi bổ sung dịch giống đã hoạt hóa vào theo tỷ lệ 1/10 và acid acetic (5 ml), lắc 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào hộp nhựa đã được hấp tiệt trùng. Nuôi cấy tĩnh tong 7 ngày, thu được sản phẩm màng CVK thô.
2.3.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Màng CVK sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như acid acetic. Vì vậy, trước khi hấp thu thuốc cần phải xử lý màng.
Mục đích: Loại bỏ được các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.
Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tạo thành màng dày ở mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
+ Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ.
+ Sau khi ngâm NaOH, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng CVK cần đạt là trung tính, ta thu được CVK tinh khiết.
2.3.3. Đánh giá độ tinh khiết của màng CVK
Mục đích: Nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại được các tạp chất có thể gây độc hại. Chất được khảo sát là đường glucose và protein của vi khuẩn.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong màng CVK tinh chế
Nguyên tắc: + Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
Tiến hành:
+ Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
+ Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling rồi ngâm trong cốc nước nóng.
+ Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
*Tìm sự hiện diện của protein trong màng CVK tinh chế
Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo kết tủa của protein với acid triclor acetic.
Tiến hành: Màng CVK tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất, lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút. Dùng dung dịch acid triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng. Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn). Phản ứng dương tính khi cho kết tủa đục. So sánh với mẫu chứng âm không chứa protein.
Màng CVK tinh chế dùng để tạo màng nạp thuốc phải đạt được những tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô.
2.3.4. Phương pháp xây dựng đường chuẩn
Phương pháp: Dùng máy quét quang phổ UV-Vis
Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV-Vis (phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử) phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử.
Chúng tôi sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến. Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Chúng tôi sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ±0,005cm. Các cuvet đo được làm sạch và thao tác thận trọng [12].
Pha dãy dung dịch Omeprazole trong HCl 0,1N ở các nồng độ (%) khác nhau: 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%. Quét phổ dung dịch Omeprazole có
nồng độ 40% trong khoảng bước sóng từ 200 đến 800nm, lựa chọn bước sóng tại đó Omeprazole đạt cực đại (λmax) hấp thụ.
Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên tại bước sóng đã lựa chọn với mẫu trắng là dung dịch HCl 0,1N và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ Omeprazole.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của các dung dịch đã pha như trên ở hấp thu cực đại (λmax).
Tiến hành đo 3 lần, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc Omeprazole để xây dựng đường chuẩn của thuốc. Phương trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Omeprazole và độ hấp thụ.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng:
y = ax + b với R2 là hệ số tương quan Trong đó: y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax
x: nồng độ của dung dịch
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau.
Làm tương tự trên khảo sát phổ Omeprazole và xây dựng khoảng tuyến tính định lượng (đường chuẩn) của Omeprazole trong môi trường pH = 2,0;
4,5 và 6,8.
2.3.5. Chuẩn bị môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline)-PBS 1X Môi trường đệm dùng để giải phóng thuốc được trích dẫn theo bảng 2.4.
Bảng 2.4. Môi trường đệm PBS
Hóa chất Cách pha
Thành phần Khối lượng Cho hóa chất vào cốc đong Thêm đến mức 800ml bằng nước cất
NaCl 0,8g
Điều chỉnh pH tới 2 ; 4,5 và 6,8 bằng
KCl 0,2g
HCl và NAOH
Na2HPO4 1,44g
Bổ sung nước tới 1000ml
KH2PO4 0,24g
Khử trùng
2.3.6. Xác định lượng Omeprazole nạp vào màng CVK
Lượng thuốc Omeprazole hấp thụ vào màng CVK được tiến hành thử nghiệm trên 2 mẫu.
Mẫu 1: Dùng màng CVK có độ dày 0,5cm.
Mẫu 2: Dùng màng CVK có độ dày 1cm.
Cho 2 mẫu màng đã sấy loại bớt 50% nước vào 2 bình tam giác có chứa sẵn 100ml dung dịch Omeprazole. Sau đó cho vào máy lắc, sau 30 phút, 1giờ, 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ để xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng đến khi giá trị OD không đổi, lặp lại thí nghiệm 3 lần lấy giá trị trung bình để tính toán [11].
Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được nồng độ Omeprazole (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng Omeprazole có trong dung dịch.
Để tính được lượng thuốc hấp thụ qua màng, áp dụng công thức (1).
mht = mtrước - msau (1)
Trong đó:
mht: Lượng thuốc hấp thụ vào màng.
mtrước: Lượng chất tan ban đầu.
msau: Lượng chất tan còn lại trong dung môi.
Hiệu suất thuốc nạp vào màng CVK được tính theo công thức 2 [14].
EE (%) = mht/mtrước x 100% (2)
Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào màng.
2.3.7. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống được thiết kế
Lượng thuốc được giải phóng qua hệ thống vận tải được tiến hành thử nghiệm ở dung dịch đệm có pH là 2; 4,5; 6,8 [14].
Pha 3 dung dịch đệm có pH như trên theo cách pha chế một số dung dịch chuẩn độ theo Dược điển Việt Nam [12].
+ Dung dịch đệm pH = 2,0: Hoà tan 6,57g kali clorid trong nước, thêm 119ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1.000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng HCl hoặc NaOH).
+ Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong 1.000ml nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH).
+ Dung dịch đệm pH = 6,8: Hoà tan 28,80 g dinatri hydrophosphat và 11,45 g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1.000 ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).
2.3.8. Nghiên cứu giải phóng thuốc từ hệ CVK nạp thuốc với các loại màng CVK có kích thước khác nhau và điều kiện môi trường khác nhau
Môi trường khảo sát là pH = 2, pH = 4,5, pH = 6,8 [14, 15].
Cách tiến hành thí nghiệm:
- Lấy các màng CVK đã được nạp thuốc cho vào các bình chứa 900ml môi trường pH như trên [12].
- Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 370C ± 0,50C.
- Sau các khoảng thời gian 0,5h; 1h; 1,5; 2h; 4h; 6h; 8h; 12h; 24h, tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ của các mẫu đó.
- Số lượng mẫu được rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và được bổ sung lại 5ml dung dịch đệm tương ứng.
- Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để tính toán lấy giá trị trung bình.
Tỉ lệ giải phóng thuốc được tính theo công thức 3 [14].
R% = 𝐶𝑡𝑥𝑉1+ ∑ 𝐶𝑖𝑥𝑉2
𝑖=𝑛−1 𝑖=1
𝑚 x 100% (3)
Trong đó: R: Tỉ lệ giải phóng thuốc.
Ct: Nồng độ của dung dịch thuốc trong dung dịch tại thời điểm t.
V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau.
n: Số lượng mẫu lấy ra từ dung dịch giải phóng V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào
m: khối lượng thuốc hấp thu vào các màng CVK
2.3.9. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK nạp thuốc Kiểm tra động dược học và cơ chế giải phóng của Omeprazole từ CVK, các dữ liệu thu được từ các thí nghiệm được phân tích bởi các mô hình khác nhau như First - order, Higuchi, Hixson - Crowell và Korsmeyer – Peppas [12].
Phương trình được sử dụng là:
* Động học bậc 0 - Phương trình: C = kt
Trong đó: C: Nồng độ dược chất giải phóng sau thời gian t
k: Hằng số tốc độ giải phóng dược chất theo thời gian t: Thời gian (giờ)
- Động học bậc 0 mô tả quá trình giải phóng thuốc ra khỏi hệ là hằng định không phụ thuộc vào nồng độ của nó trong hệ.
* Động học Korsmeyer – Peppas - Phương trình:Q = kKPtn
Trong đó: Q: Lượng thuốc giải phóng theo thời gian kKP : Hằng số giải phóng
t: Thời gian
n: Trị số mũ giải phóng
- Động học Korsmeyer – Peppas mô tả quá trình giải phóng thuốc ra khỏi hệ theo cơ chế khuếch tán tỷ lệ với sự trương nở của vật liệu mang thuốc.
Nồng độ dược chất (C) và lượng dược chất giải phóng (Q) được thay bằng phần trăm giải phóng thuốc theo thời gian t [16].
* Động học Higuchi: Qt = kHt1/2
* Động học First - order: Ln(Qo - Qt) = k1t * Động học Hixson - Crowell: Q01/3 - Qt1/3
= kHCt 2.3.10. Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để tính toán.
Các số liệu được phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2013 và được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của hai mẫu bằng cách sử dụng test thống kê. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05. Dược động học giải phóng và các thông số dược động học được tính toán, xử lý bằng phần mềm DDSolver, PKSolver.