a. Khái quá về enzyme amylase.
b. Các phương pháp đo hoạt tính enzyme amylase.
- Nguyên tắc chung dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme trong dd enzyme nghiên cứu thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu sẽ tính được hoạt tính của enzyme.
- Đơn vị amylase (theo Smith và Roe) là lượn enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút trong điều kiện thí nghiệm.
THỰC HÀNH:
1. Dụng cụ - hóa chất:
a. Dụng cụ.
- Máy lắc.
- Máy đo quang phổ, cuvette dày 1cm.
- Bể điều khiển.
- Bình định mức.
- Ống nghiệm.
- Pipette 5ml, 1ml.
- Đồng hồ bấm giây.
- Giấy thấm.
- Giá để ống nghiệm.
- Bình tia đựng cồn.
b. Hóa chất:
Dung dịch đệm.
- Dung dịch đệm
- Dung dịch đệm acetate pH= 4,7 (xác định hoạt tính enzyme nấm mốc): trộn 1 thể tích CH 3COOH 1N với 1 thể tích CH 3COONa 1N. Kiểm tra pH.
- Dung dịch đệm phosphate pH= 4,9 (xác định hoạt tính enzyme của malt): trộn 10 ml dung dịch Na 2HPO 4 1/15 M với 990 ml dung dịch KH 2PO 4 1/15 M nhận được 1 l dung dịch đệm phosphate pH = 4,94. Kiểm tra pH.
- Dung dịch đệm glycine – NaOH 0,1 M pH = 10 (dùng đ ể xác định hoạt tính 𝛼 −amylase kiềm.
- Dung dịch HCl 0,1N .
- Dung dịch iod: hòa tan 30 mg KI và 3 mg I2 v ới một lượng nhỏ nước cất. Lắc nhẹ hỗn hợp để hòa tan hoàn toàn, sau đó chuyển dung dịch sang b ình định mức 1000 ml, bổ sung nước cất đến vạch mức. Bảo quản dung dịch trong b ình màu nâu để chỗ tối.
- Dung dịch tinh bột 1%: h òa tan 1 g tinh b ột (theo chất khô tuyệt đối) với 50 ml nước cất trong bình định mức 100 ml, lắc đều. Đặt v ào bếp cách thủy đang sôi, lắc li ên tục cho đến khi tinh bột tan ho àn toàn. Sau đó làm ngu ội và bổ sung 10 ml đệm acetate pH = 4,7 (hoặc 10 ml dung dịch đệm phosphate pH = 4,9) bổ sung n ước cất đến vạch mức, lắc đều. Dung dịch đ ược chuẩn bị trong ngày sử dụng.
- Dung dịch enzyme gốc.
Trích ly enzyme:
Enzyme được trích ly từ chế phẩm hay tế bào, mô động thực vật bằng dd đệm có pH thích hợp như
- Trích ly enzyme từ vi khuẩn: Cân m= 0,1g chế phẩm dùng đũa thủy tinh chà nhẹ chế phẩm trong cốc dt 50ml cho vào bình định mức 100ml + H2O cất lọc và trích ly enzyme bảo quản 2-4°𝐶 / 1 ngày.
- Trích ly enzyme nấm mốc: Cân m=5g chế phẩm dùng đũa thủy tinh chà nhẹ chế phẩm trong cốc dt 50ml cho vào bình định mức 100ml + H2O cất +dd đệm
Acetate pH=4,7 giữ nhiệt độ 30°𝐶 trong 1 giờ lọc, rửa, trích ly lấy enzyme V=
100ml bảo quản 2-4°𝐶 / 1 ngày.
- Trích ly enzyme từ malt: Cân m=5-10g chế phẩm xay nhỏ cho vào bình định mức 100ml + H2O cất +dd đệm phosphase pH=4,9 lọc, rửa, trích ly lấy enzyme V= 100ml bảo quản 2-4°𝐶 / 1 ngày.
Pha loãng enzyme:
Hệ số pha loãng : n= 50,100,200 Xác định hoạt tính thí nghiệm:
Hóa chất Thí nghiệm Đối chứng Mẫu trắng
Dd Tinh bột 1% 2 ml 2 ml 0
Nước cất 0 0 2ml
Đệm 1ml 1ml 1ml
Dd NaCl 3% 0,5ml 0,5ml 0,5ml
ủ 40 °𝐶 , 10 phút để đạt điều kiện enzyme hoạt động tốt.
Dd enzyme 1ml 0 0
ủ 40 °𝐶 , 30 phút để xảy ra phản ứng
HCl 1N 1ml 1ml 1ml
Dd enzyme 0 1ml 1ml
Chuyển sang bình định mức 100ml.
Nước cất Đến vạch Đến vạch Đến vạch
Iod 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Tính kết quả:
0𝐷0: 𝑙à 𝑚ậ𝑡 độ đ𝑜 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔 0𝐷: 𝑙à 𝑚ậ𝑡 độ đ𝑜 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 𝑡ℎí 𝑛𝑔ℎ𝑖ệ𝑚.
𝑆ố 𝑚𝑔 𝑡𝑖𝑛ℎ 𝑏ộ𝑡 𝑏ị 𝑡ℎủ𝑦 𝑝ℎâ𝑛 𝑆 = 0𝐷0𝐷0−0𝐷
0 × 20 = 1,072−0,106
1,072 × 20 = 18,022
𝐻𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ ( đơ𝑛 𝑣ị ℎ𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ
𝑔 ) = 𝑆 × 𝑛 × 𝑉
10 × 𝑚 = 18,022 × 50 × 100
10 × 10 = 901,1 Họat tính riêng (đơn vị họat tính/mg protein) = họat tính toàn phần/mg protein (Bradford).
Trong đó : n = hệ số pha loãng
V= thể tích dịch trích ly, ml.
m= khối lượng enzyme đem trích ly, g
CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1: Phân biệt các dạng chính của enzyme amylase và nguồn thu chúng.
Có 3 dạng chính:
--amylase (Endo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.1) có trong nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm, tụy tạng, nấm mốc, vi khuẩn
--amylase (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) có nhiều ở thực vật (hạt củ)
-Glucoamylase
Câu 2: Bản chất của hoạt tính enzyme là gì? Nêu các phương pháp đo hoạt tính của enzyme
Bản chất: hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn.
Hai nhóm phương pháp chính sau:
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định.
Câu 3: Cơ chất và sản phẩm của enzyme -amylase là gì? Dựa trên pp nào người ta chọn pp xác định hoạt tính như trong thí nghiệm?
Cơ chất của enzyme -amylase là tinh bột. Enzyme này phân giải liên kết 1,4- glycoside ở giữa chuỗi polysaccharide (hoạt tính endoamylase) tạo thành maltose, dextrin phân tử thấp.
Nguyên tắc chung dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme trong dung dịch enzyme nghiên cứu thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iode bằng máy so màu sẽ tính được hoạt tính enzyme.
Câu 4: Có thể sử dụng pp đo đường khử bằng DNS acid để đo hoạt tính enzyme - amylase không? Tại sao?
Vì DNS tạo màu với đường khử còn trong bài là đo hoạt tính enzyme -amylase là tinh bột tạo màu với lugol.
Câu 5: Cho biết định nghĩa đơn vị hoạt tính theo Smith và Roe. Đơn vị này có giống đơn vị quốc tế không? Ta có thể chuyển đơn vị Smith và Roe thành đơn vị quốc tế không nếu giữ nguyên pp xác định như trong bài.
Đơn vị amylase (theo Smith và Roe) là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút trong điều kiện thí nghiệm.
Đơn vị này không giống đơn vị quốc tế.