Phương pháp nghiên cứu - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP- 123docz.net

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chiết xu t, phân lập hợp ch t

Mẫu nghiên cứu sau khi được rửa sạch và phơi khô, thái nhỏ và ngâm chiết 3 lần trong dung môi ethanol, sử dụng chiết bằng thiết bị siêu âm (50oC, 3 giờ). Dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao toàn phần.

Phân tán cao chiết này trong nước rồi chiết phân bố với các dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực là n-hexan và ethyl acetat. ác phân đoạn n- hexan, ethyl acetat được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao từng phân đoạn tương ứng.

Hình 2.2: Sơ đồ chiết tách phân đoạn Dược liệu

Dịch chiết ethanol

Chiết với ethanol

Cao tổng ethanol

Phân tán trong H2O

Lắc phân đoạn với n-hexan Thu hồi dung môi

Phân đoạn n- hexan Phân đoạn nước

Lắc với ethyl acetat

Phân đoạn ethyl acetat Phân đoạn H2O Thu hồi dung môi

Lựa chọn phân đoạn có tiềm năng bằng sắc kí lớp mỏng, tiến hành xử lý và phân lập. Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ các phân đoạn đã chọn chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột. ác phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điều chế.

Sắc ký cột : được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Silica gel pha thường cỡ hạt là 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.

Sắc ký lớp mỏng TL : được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 Merck , độ dày 0,2 mm và RP-18 F254s, độ dày 0,25 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ.

Sắc ký lớp mỏng điều chế pTL : được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60G F254, độ dày 1,0 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, đốt nóng trên bếp điện từ, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất bằng dung môi thích hợp.

2.2.2. Phương pháp xác định c u trúc hợp ch t

Xác định cấu trúc của các chất phân lập được dựa trên phân tích kết quả phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), ngoài ra còn kết hợp với các thông số vật lí như Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS), Góc quay cực được đo bằng máy DIP- 360, Điểm nóng chảy Mp và so sánh các dữ liệu thực nghiệm và các dữ liệu được công bố để đưa ra kết quả chính xác nhất.

a, Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng của

ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng m và điện tích (z) của ion (m/z). Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion.

Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [16].

b, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ 1H, 13 ... được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường . Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. ó 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này. Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét. Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay [16].

Nguyên thuỷ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử. Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi

theo từ trường ngoài B0. Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó. Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân. Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học. Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0-14 ppm, còn của carbon-13 là từ 0-240 ppm [16].

Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao. Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz... là theo tần số dùng để kích thích các proton [16].

Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay

13 như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [16].

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. ác proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba tới 7 đỉnh thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó [16].

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm. Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Carbon lai hóa sp2

chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết đôi với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử [16].

Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử.

Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) [16].

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn long-range H T OR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY) [16].

Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữa các proton và carbon trong phân tử. Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác ta có thể xây dựng và nhận dạng được cấu trúc phân tử của hợp chất [16].