Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại sinh đến sự hình th- 123docz.net

3. GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HÓA

1.1.9 Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại sinh đến sự hình thành gốc tự do

Đây là các chất hóa học, cơ thể không tổng hợp sẵn được, ví dụ như các thuốc trừ sâu, diệt cỏ, các hợp chất nitro hữu cơ, các phẩm nhuộm. Khi xâm nhập vào cơ thể, các hóa chất này có giai đạon trung gian tạo ra các gốc tự do.

1.1.9.2 Ảnh hưởng của các tác nhân viêm và hoại tử gan

Các hợp chất halogen hữu cơ, điển hình là CCl4 là chất gây viêm hoại tử gan.

Khi vào gan được chuyển hóa như sau:

CCl4 → oCCl3 → Cl3COOo →…COCL2 (Phoshen)

Chính các dạng gốc trung gian này làm tăng quá trình peroxy hóa lipid. Quá trình peroxy hóa lipid mãnh liệt sẽ gây phá vỡ màng tế bào, gây viêm và có khả năng gây hoại tử gan.

1.1.9.3 Ảnh hưởng các tác nhân tiêu hóa và bầm huyết

Điển hình là các diazonaphtol, diphenylhydrazin…, các chất này phản ứng với oxyhemolobin tạo ra methemoglobin và gốc phenylhydrazin. Gốc này nhường điện tử oxy tạo ra Oo-2

Hb(Fe+2)O + PhNH - NH2 → Hb(Fe+3) + H2O + Ph - No - NH2

Ph – No - NH2 → Oo-2 + Ph - N = NH + H+ 1.1.9.4 Ảnh hưởng của điều kiện sống

Ảnh hưởng của sự ô nhiểm môi trường

Khí thải của các động cơ dùng xăng, dầu có nhiều chất độc như: CO. NO, carbuahydro tetraethyl chì. Những chất này phân hủy gốc tự do như sau:

Pd(C2H5)4 + O2 → PbOo2 → RCH2Oo → HOo2 → oOH + … Ảnh hưởng của stress

Cơ thể hoạt động bình thường là do cân bằng nội môi đã được thiết lập. Nếu có một yếu tố nào phá vở cân bằng nội môi thì được gọi là tác động của stress. Khi cơ thể bị các stress như sự di chuyển và thay đổi môi trường sống, sự thay đổi nhiệt độ quá nóng hay quá lạnh, môi trường quá ồn hay bị ô nhiễm, áp lục và sự cân bằng – lo lắng trong công việc, v.v., thì hàm lượng gốc tự do của oxy thường cao hơn 1,5 đến 2 lần so với đối chứng. thong qua các dây thần kinh hướng tâm thần và vùng dưới đồi cơ thể có những đáp ứng với các stress. Sự giải phóng ra adrenalin và noradrenalin, khi cơ thể bị tresss tác động sẽ dẫn tới khả năng tương tác với oxy sẽ tạp ra các gốc Oo2. Đồng thời nhiều acid béo chưa no được giải phòng ra từ các lipid. Những yếu tố đó thúc đẩy quá trình peroxy hóa tang khi bị stress.

Ảnh hưởng của khu vực địa lý

Các bức xạ mặt trời, bức xạ nền ở một miền nào đó có phát ra những tia ảnh hưởng đến sự hình thành các gốc tự do của oxy theo cơ chế sau:

RH → Ro + Ho H2O → Ho + OHo R → ROOo

H2O → oOh + H+ + e_

Tóm lại, do ảnh hưởng của các điều kiện sống như bị ô nhiễm quá nhiều, nhiều stress… thì gốc tự do gia tăng. Nếu sự gia tang quá mức và kéo dài sẽ dẫn đến tình trạng mất cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các chất chống oxy hóa. Lượng

các dạng oxy hoạt động tang sẽ gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguên nhân của nhiều bệnh tật.

1.1.9.5 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro 1.1.9.5.1 Phương pháp 1

Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng thử nghiệm DPPH (Viện Dược liệu, 2006; Kulisic et al., 2004; Obeid et al., 2005).

DPPH là gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 517nm.

- Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử

Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0.5mM trong methanol bằng cách hòa tan 4.929mg DPPH với một lượng methanol vừa đủ tan DPPH, sau đó cho vào bình định mức và thêm methanol vừa đủ 25mL. Pha xong dùng ngay, đựng trong chai thủy tinh màu.

Mẫu thử: cao cồn toàn phần và các cao phân đoạn n-hexan, cloroform, etylacetat, nước được hũa tan với methanol để đạt được nồng độ ban đầu là 20àg/mL đối với cao khô. Nếu khó tan có thể dùng DMSO trợ tan.

Đối chứng dương được sử dụng là vitamin C.

Mẫu thử có HTCO (%) cao nhất và chứng dương được tiến hành khảo sát ở các nồng độ khác nhau để tìm IC50.

Tiến hành quy trình thử nghiệm

Bảng 2.1 Phản ứng thử nghiệm DPPH Ống Dung dịch thử

(mL)

Dung dịch MeOH (mL)

Dung dịch DPPH (mL)

Trắng 0 4,0 0

Chứng 0 3,0 1

Thử 1 2,0 1

Hỗn hợp sau khi pha để trong tối, ở nhiệt độ phòng 30 phút.

Đo quang ở bước sóng 517 nm.

Cách tính kết quả

Hoạt tính chống oxy hóa HTCO (%) được tính theo công thức:

ODc ODt HTCO (ODc )

(%) 

  100

Trong đó:

ODc: Mật độ quang của dung dịch DPPH và MeOH.

ODt: Mật độ quang của DPPH và mẫu thử.

Từ nồng độ giai mẫu thử đã pha và HTCO (%) tính toán được, dựa vào các thuật toán trong phần mềm Microsoft Office Excel 2010, lập phương trình hồi quy có dạng y = ax + b thể hiện mối tương quan giữa HTCO (%) (y) và nồng độ (x). Từ đó, xác định IC50 bằng cách thế y = 50 vào phương trình hồi quy. IC50 mẫu thử có nồng độ càng thấp tức là mẫu thử có tác dụng loại bỏ gốc tự do càng mạnh.

Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị trung bình của 3 lần đo khác nhau.

1.1.9.5.2 Phương pháp 2

Hoạt tính chống oxy hóa được xác định bằng thử nghiệm DPPH (Viện Dược liệu, 2006; Chanda S. et al, 2009; Wojdylo A. et al, 2007)

* Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử

Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0.6mM trong methanol bằng cách hòa tan 5.915mg DPPH với một lượng methanol vừa đủ tan DPPH, sau đó cho vào bình định mức và thêm methanol vừa đủ 25mL. Pha xong dùng ngay, đựng trong chai thủy tinh màu.

Mẫu thử: Khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các mẫu cao toàn phần từ các mẫu nguyên liệu dược liệu. Các cao được hòa tan với methanol để đạt được nồng độ ban đầu là 1mg/mL đối với dược liệu khô. Nếu khó tan có thể dùng DMSO trợ tan.

Đối chứng dương được sử dụng là vitamin C và trolox.

Các mẫu thử và chứng dương được tiến hành khảo sát ở 5 nồng độ khác nhau.

Tiến hành quy trình thử nghiệm

Bảng 2.2 Phản ứng thử nghiệm DPPH

Ống Dung dịch thử

(mL)

Dung dịch MeOH (mL)

Dung dịch DPPH (mL)

Trắng 0 4 0

Chứng 0 3,5 0,5

Thử 0,5 3 0,5 Hỗn hợp sau khi pha để trong tối, ở nhiệt độ phòng 30 phút.

Đo quang ở bước sóng 517 nm.

Cách tính kết quả: