Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử

2.3. Chỉ thị phân tử

2.3.2. Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử

Bên cạnh nhiều biện pháp phòng trừ bệnh xoăn vàng lá đã được đề cấp ở trên, tạo giống kháng bệnh là hướng đi rất được chú ý. Theo Friedmann và cs (1998)[25] đã tạo được dòng cà chua TY172 (Solanum peruvianum) kháng tuyệt đối với TYLCV trong khi đó nhiều giống lai thương mại đều biểu hiện triệu chứng bệnh ở mức độ khác nhau. Tính kháng bệnh của TY172 được quy định do một số QTL, có 1 QTL chính trên NST số 4 gọi là Ty5 chiếm 39,7 - 46,6% trong mức độ kháng bệnh, một số QTL khác nằm trên NST số 1, 7, 9, và 11 chi phối khoảng 12% tính kháng.

Zamir và cs (1994)[34] cho rằng tính kháng TYLCV của mẫu giống cà chua LA1969 (S.chilense) do một gen chính trội không hoàn toàn Ty1/ty1 và một số gen phụ quy định. Gen Ty1 nằm trên NSTsố 6, khu vực chỉ thị TG297 và TG97. Tính kháng bệnh của mẫu giống này đã được dùng để tạo ra một số giống cà chua thương mại. Để thuận tiện cho tạo giống, chỉ thị phân tử CAPS liên kết chặt với gen Ty1 đã được phát triển. Bên cạch gen Ty1, một số gen quy định tính kháng TYLCV cũng được xác định và lập bản đồ, đã xác định 3 vùng đóng góp vào tính kháng bệnh trong các dòng cà chua được tạo ra từ mẫu giống LA2779 (S.chilense) hay LA1932, một vùng chứa locus Ty1, vùng khác là locus Ty3 được lập bản đồ trong khoảng cLEG-31-P16 (20cM) và T1079 (27cM). Vùng thứ 3 nằm gần gen sp (self - pruning) [18].

Trong những năm gần đây, các chương trình tạo giống cà chua kháng TYLCV bằng chỉ thị phân tử ở Việt Nam cũng bắt đầu được thực hiện. Phan Hữu Tôn và cs (2013)[15] qua khảo sát 200 mẫu giống cà chua đã xác định được 7 mẫu giống mang gen Ty1, 7 mẫu giống mang gen Ty3, trong đó có 2 mẫu giống mang cả gen Ty1 và Ty3.

Trần Ngọc Hùng (2013)[8] đã tạo được một số tổ hợp lai cà chua (F1) mang đồng thời cả gen kháng bệnh sương mai (Ph3) và gen kháng TYLCV (Ty1, Ty3), có năng suất cao và chất lượng tốt.

Phần 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1. Đối tượng, hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy 3.1.1.1. Đối tượng

Thí nghiệm bao gồm 29 mẫu dòng cà chua do Viện Nghiên cứu Rau quả cung cấp. Mã hiệu của 29 dòng cà chua được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Mã hiệu của các dòng cà chua

TT Mã hiệu Tên giống/Phả hệ

1 14-TYS-01 {(08-MAS 1-12-1 x GC 9-1)-8-7-2 x 11CH7}-3-1 2 14-TYS-02 {(08-MAS 1-12-1 x GC 9-1)-8-7-2 x 11CH7}-3-2 3 14-TYS-03 {(08-MAS 1-12-1 x GC 9-1)-8-7-2 x 11CH7}-3-3 4 14-TYS-04 {(08-MAS 1-12-1 x GC 9-1)-9-3 x 11CH7}-6-15-1 5 14-TYS-05 {(08-MAS 1-12-1 x GC 9-1)-9-3 x 11CH7}-6-15-2 6 14-TYS-06 {(08-MAS 1-12-1 x GC 9-1)-9-3 x 11CH7}-6-15-3 7 14-TYS-07 {(CLN3125F2-2-7-1-5 x Terminal) x Lyco9}-7-12-1 8 14-TYS-09 {(CLN3125F2-2-7-1-5 x Terminal) x Lyco9}-7-12-3 9 14-TYS-11 {(CLN3125F2-2-7-1-5 x Terminal) x Lyco9}-7-5-2 10 14-TYS-13 {(CLN3125F2-2-7-4-2 x Terminal) x Lyco9}-12-1-2 11 14-TYS-16 {(No1 x CLN3125F2-2-7-4-2) x lyco9}-8-1

12 14-TYS-17 {(No1 x CLN3125F2-2-7-4-2) x lyco9}-8-2 13 14-TYS-18 {(No1 x CLN3125F2-2-7-4-2) x Super}-10-10-1 14 14-TYS-19 {(Sarang x GC9) x Sarang}-1-3-12-1

15 14-TYS-21 {(Megic x GC9) x Megic}-10-2-1 16 14-TYS-22 {(Megic x GC9) x Megic}-10-2-2 17 14-TYS-23 11AV-06

18 14-TYS-24 11AV-09 -1

19 14-TYS-27 11AV-10 20 14-TYS-28 11-E-01 21 14-TYS-29 11-E-02 22 14-TYS-31 GC171 23 14-TYS-32 Sav-10-1-1 24 14-TYS-34 Sav-9-5-1 25 14-TYS-37 Sav-9-7-1 26 14-TYS-38 Sav-9-7-2 27 14-TYS-39 Sav-9-7-3 28 14-TYS-40 Sav-9-9-1 29 14-TYS-41 Sav-9-9-2 3.1.1.2. Hóa chất

Các hóa chất chính dùng trong các thí nghiệm như sau: dNTPs (hãng Fermentas, Đức), taq DNA polymeraze (hãng Fermentas, Đức), mồi xuôi, mồi ngược (hãng IDT, Mỹ), 10X PCR Buffer (hãng Fermentas, Đức), marker (hãng Fermentas, Đức).

Ngoài ra còn sử dụng các hóa chất khác như: Tris-HCl, EDTA, SDS, K-acetat, isopropanol, cồn, DNA loading dye, edthidium bromide, acid acetic , nước khử ion...

Các chỉ thị được dùng trong nghiên cứu để xác định kiểu gen liên quan đến tính kháng bệnh xoăn vàng lá có trong bảng 3.3.

Bảng 3.2: Các chỉ thị phân tử Gen Chỉ thị phân tử

Ty1 Ty-Seminis

Ty2 T0302

Ty3 P6-25

3.1.1.3. Thiết bị

Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.4.

Bảng 3.3: Các thiết bị chính sử dụng trong sinh học phân tử

STT Tên thiết bị Hãng, nước sản xuất

1 Bộ điện di agarose Power Pac 300 BioRad, Singapore

2 Máy nhân gen (PCR) Eppendorf, Đức

3 Bể ổn nhiệt Memmert, Đức

4 Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417R Eppendorf, Đức 5 Máy ly tâm mini Spectrafuge Labnet, Mỹ 6 Máy lắc nghiền mô lá MM 301 Retsch, Đức

7 Bộ micropipet Eppendorf, Đức

8 Tủ lạnh -20oC Sanaky, Nhật Bản

3.1.1.4. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật

Vi sinh vật sử dụng để lây nhiễm nhân tạo cho các dòng cà chua là Agrobacterium chứa cấu trúc TYLCV, được nuôi cấy trong MT LB.

Thành phần môi trường và cách pha MT được thể hiện ở bảng sau.

Bảng 3.4: Môi trường LB

STT Thành phần Khối lượng Tiến hành

1 Peptone 2,5g Cho các thành phần vào, chuẩn lên thể tích 250 ml. Lắc đều cho tan, hấp ở 121 oC/ 15 phút.

Rót ra đĩa Petri để môi trường nguội khoảng 55 oC, bổ xung kháng sinh.

2 Cao nấm men 1,25g

3 NaCl 1,25g

4 Agar 3,75g

3.1.2. Phạm vi nghiên cứu

Xác định gen kháng TYLCV của 29 dòng cà chua.

Đánh giá các đặc tính nông sinh học.

3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm thực hiện đề tài: Viện Nghiên cứu Rau quả, Gia Lâm, Hà Nội.

Thời gian thực hiện đề tài : từ 12/2013 đến 06/2014.

3.3. Nội dung nghiên cứu

3.3.1. Nội dung 1: Chọn lọc các dòng cà chua kháng TYLCV bằng chỉ thị phân tử

3.3.1.1.Tách DNA tổng số từ mô lá

3.3.1.2. Chọn lọc các dòng cà chua kháng TYLCV bằng kỹ thuật PCR

3.3.2. Nội dung 2: Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các dòng cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá

3.3.3.1. Đặc điểm quả 3.3.3.2. Tính chịu nhiệt

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Chọn tạo các dòng cà chua kháng TYLCV bằng chỉ thị phân tử

Các mẫu giống cà chua cần nghiên cứu được xử lý hạt bằng dung dịch NaClO (natri hipoclorit) 1% trong 15 phút sau đó làm sạch bằng cách để dưới vòi nước chảy liên tục trong 30 giây rồi hong khô trước khi gieo.

Sử dụng khay nhựa (72 lỗ) và giá thể GT5 (Viện Thổ nhưỡng Nông hóa) phối trộn với xơ dừa sạch theo tỉ lệ 1:1 (theo thể tích) để gieo hạt. Khay đã gieo hạt được để trên giá cao 80cm, trong nhà lưới và luôn đảm bảo đủ ẩm, nhiệt độ 250C-320C.

Cây trồng khoảng 25-30 ngày tuổi, được lây nhiễm virus nhân tạo.

Phương phỏp lõy nhiễm: tiờm trực tiếp vào mụ. Tiờm 0,1àl dịch vi khuẩn vào cây cà chua ở giai đoạn 2-3 lá, 2 đến 3 ngày sau tiêm nhắc lại một lần.

Vị trí tiêm: nách lá, thân. Sau thời gian theo dõi cây nào kháng TYLCV sẽ được đem trồng ngoài đồng ruộng. Cây được 35 - 40 ngày tuổi, chọn các cây thể hiện tính kháng tốt đem trồng ngoài ruộng, khi cây xuất hiện từ 3 - 4 lá thật sẽ ly trích DNA.

3.4.1.1. Thu mẫu, tách chiết DNA

Các mẫu cà chua được tách chiết DNA tổng số dựa trên phương pháp của Evenyl Klocke và cs (1997)[22]. Cụ thể quy trình như sau:

Bước 1: Cho 400 àl solution I (0,2M Tris-HCl+ 0,25M EDTA+ 0,5% SDS) vào ống eppendoff có chứa 1(g) mẫu lá, sau đó cho thêm một viên bi sắt vào.

Bước 2: Nghiền mẫu bằng máy lắc 25 vòng trên giây trong 2 -3 phút.

Bước 3: Ủ ở 65oC trong vòng 15 phút, cứ 5 phút thì đảo nhẹ một lần.

Bước 4: Thờm 200 àl K - acetat vào ống mẫu, đảo đều, tiếp tục ủ trong đá vảy hoặc tủ lạnh sâu 30 phút.

Bước 5: Ly tâm 12000 vòng/phút, hút dịch lỏng chuyển sang ống eppendoff mới.

Bước 6: Bổ sung isopropanol vào và đảo nhẹ, sau đó ủ vào đá vảy hoặc tủ âm sâu 20 phút.

Bước 7: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.

Bước 8: Loại dịch thu cặn.

Bước 9: Rửa bằng cồn 70%.

Bước 10: Để khô trong điều kiện bình thường.

Bước 11: Hòa tan bằng TE và bảo quản ở - 200C.

3.4.1.2. Chọn lọc các dòng cà chua kháng TYLCV bằng phản ứng PCR Thành phần hóa chất sử dụng cho PCR được thể hiện trong bảng sau.

Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng PCR Húa chất Thể tớch (àl)

Nước khử ion 5,9

10X PCR Buffer 1,0

dNTPs (2,5àM) 1,0

Mồi xuụi (50àM) 0,5

Mồi ngược (50àM) 0,5

Taq DNA Polymerase (5U/àl) 0,1

Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện như bảng 3.7.

Bảng 3.6: Quy trình thực hiện phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệt độ( oC) Thời gian Số chu kỳ

Biến tính khởi đầu 94 2 phút 1

Các chu kỳ tổng hợp

94 30 giây

58 20 giây 30

72 30 giây

Kết thúc 72 5 phút 1

Sau khi kết thúc quy trình, sản phẩm bảo quản ở 4oC cho đến khi thực hiện các phản ứng tiếp theo.

- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Bước 1: Chuẩn bị bản gel 1,5% agarose trong TAE 0,5X. Hòa tan hoàn toàn agarose trong TAE bằng đun sôi trong lò vi sóng. Để nguội đến khoảng 60oC, tiến hành đổ bản gel rồi để bản gel agarose đông hoàn toàn.

Bước 2: Chạy điện di:

Tra mẫu: trộn lẫn DNA và loading dye 6X theo tỷ lệ 5 : 1, sau đó tra hỗn hợp vào giếng. Chạy điện di ở hiệu điện thế 110V trong khoảng 30 phút.

Nhuộm bản gel với dung dịch edthidium bromide trong 30 phút.

Hiển thị kết quả điện di dưới tia UV, ghi lại hình ảnh điện di.

Phân tích kết quả điện di.

3.4.2. Đánh giá đặc điểm nông sinh học

Sau khi xác định được kiểu gen bằng chỉ thị phân tử ở giai đoạn vườn ươm, các mẫu giống mang gen kháng bệnh sẽ được trồng ra ruộng để đánh giá đặc điểm nông sinh học.

Thí nghiệm đánh giá đặc điểm nông sinh học (năng suất, dạng quả, chất lượng quả), được bố trí theo phương pháp tuần tự, không lặp lại.

Khoảng cách trồng : cây x hàng = 40cm x 70 cm. Số liệu thu thập được sử lý thống kê theo chương trình SAS.

- Một số chỉ tiêu nông sinh học chính được đánh giá như sau (mỗi dòng, giống thực hiện trên 3 cây ngẫu nhiên).

+ Độ đường (%) đo bằng cách dùng chiết quang kế.

+ Chiều cao quả (cm) đo bằng thước kẹp của 3 quả trung bình trên mỗi dòng.

+ Đường kính quả (cm) đo bằng thước kẹp tại vị trí to nhất của 3 quả trung bình.

+ Dạng quả được xác định như sau:

Dạng quả: I = H/ D (trong đó H =Chiều cao quả (cm); D= Đường kính quả (cm).

I > 1 : Dạng quả dài I = 0,8-1 : Dạng quả tròn I < 0,8 : Dạng quả dẹt

Phần 4