CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Hàm lượng chất khô biểu kiến
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí nội dung nghiên cứu 3.2.2. Khảo sát Lactobacillus delbrueckii
Giống Lactobacillus delbrueckii được tăng sinh trên môi trường MRS.
Giống được cấy vào môi trường đặc và môi trường lỏng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng.
Cấy giống vào erlen chứa môi trường MRS lỏng, lắc đều.
Tất cả môi trường được cấy giống đem vào tủ ủ ở 37oC trong 24h nhằm tăng sinh khối.
3.2.2.1. Quan sát đại thể:
Cấy trãi chủng vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii lên môi trường thạch đĩa, nuôi ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 24h. Quan sát hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc.
3.2.2.2. Quan sát vi thể:
Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào, xác định Gram.
Phương pháp nhuộm Gram do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christan Gram (1853 – 1938 ) phát minh ra từ năm 1884. Nhờ phương pháp này người ta phân biệt ra 2 nhóm vi khuẩn đó là: vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Nhuộm Gram không những giúp phân biệt được vi khuẩn nhờ các đặc điểm hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông tin về lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi
Khảo sát một số điều kiện lên men acid lactic trên môi trường rỉ đường
Tiến hành lên men thu nhận acid lactic trong hệ thống lên men liên tục bởi Lb.
delbrueckii cố định trong phức chất mang BC
pH
Thời gian lên men
peptidoglycan sẽ có màu tím, cò vi khuẩn Gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng hơn do có ít peptidoglycan hơn và được bao bọc bởi một màng mỏng sẽ có màu hồng.
Tiến hành:
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.
- Soi kính: dùng vật kính 100x.
3.2.2.3. Khảo sát khả năng tạo thành acid lactic:
Nuôi cấy vi khuẩn lactic trong môi trường MRS (nuôi cấy dịch thể), nếu vi khuẩn này sinh ra Acid lactic thì nó sẽ làm cho pH của môi trường giảm xuống.
Khoảng chênh lệch thu được về pH chính là khả năng sinh Acid lactic mạnh hay yếu của vi khuẩn đó.
3.2.2.4. Lập đồ thị chuẩn:
Mục đích: Xây dựng đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ tế bào (số tế bào/ml) và độ hấp thu (OD).
Tiến hành: Định lượng số tế bào vi khuẩn ban đầu trong dịch nuôi cấy tăng sinh sau 24h bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trong môi trường thạch đĩa. Lấy 10ml dịch lên men sau 24h đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ dịch lên men thu sinh khối. Rửa sinh khối bằng nước muối sinh lý.Hút nước muối sinh lý vào sinh khối cho đủ 10ml trong ống ly tâm. Tiến hành pha loãng mẫu với các hệ số pha loãng khác nhau và đo OD ứng với các hệ số pha loãng đó. Từ các giá trị OD tương ứng và các giá trị mật độ tế bào pha loãng tiến hành lập đường chuẩn
3.2.2.5. Khảo sát đường cong sinh trưởng trên môi trường MRS và rỉ đường.
Mục đích: Xác định các giai đoạn sinh trưởng của giống để lựa chọn thời điểm mà giống đạt chất lượng tốt nhất cho quá trình lên men và thời điểm dừng lên men.
Xử lý môi trường MRS:
Cân môi trường MRS định mức đến 1000ml
Chỉnh pH đến 6.5
Hấp khử trùng 1210 C, 15 phút
Cấy giống 3%, ủ 37 0 C . Xử lý môi trường rỉ đường:
100ml rỉ đường + 1ml H2SO4 20% đun sôi cách thủy 20 phút
10 g rỉ đường thủy phân + 0.5 g cao nấm men định mức vừa đủ 100ml
Chỉnh pH đến 6.5 bằng KOH 4M
Hấp khử trùng 1210 C, 15 phút
Cấy giống 3%, ủ 37 0 C .
Tiến hành: Nhân giống cấp 1. Cấy trãi giống trên môi trường thạch đĩa để xác định mật độ tế bào trong dịch ban đầu, đồng thời đo OD tại thời điểm này (t=0). Tiến hành nhân giống trong 30h .Sau 2h lấy mẫu đo OD để xác định mật độ tế bào.
Phương pháp đo độ đục:
Ở phương pháp này mật độ vi sinh vật có thể được xác định một cách gián tiếp thông qua đo độ đục (máy quang phổ Hewlett Packard 8453 với chương trình HPUV-Vis Chemstations ở bước sóng 600nm (AG)). Nguyên tắc dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lững trong pha lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của chúng làm phân tán chùm ánh sáng tới. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào .Trong giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào có thể xác lập quan hệ tuyến tính giữa chúng , thông qua máy so màu ở bước sóng 550- 610 nm.
•Bước 1: Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào
- Tiến hành pha loãng huyền phù vsv theo bảng 3.1:
Bảng 3.1 xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào.
Ống TN ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8
Mẫu dd (ml) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Nướcmuối sinh lý (ml) 10 9.5 9 8.5 8 7.5 7 6.5 6 OD ( 600nm)
cfu /ml *10-7
- Xác định số lượng tế bào ( cfu/ml) tương ứng theo từng mẫu ở bảng trên, Vẽ đường biểu diễn của log(N/ml) (trục tung ) theo OD600nm (trục hoành) .
•Bước 2: Xác định mật độ tế bào theo trị số OD600nm của các mẫu có tế bào vsv tương ứng cần đo được , kết hợp với đồ thị vừa lập cho phép ta xác định nồng độ tế bào trong huyền phù dịch nuôi .