NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP

- Dioxin trong mẫu phân tích sẽ kết hợp với Ah receptor thành dạng phức DRE (Dioxin responsive element).

- DER sẽ được Arnt (Arylhydrocarbon translocator) – nguyên tử di chuyển mang, định vị đến vị trí nhất định trong đoạn mã DNA. Tại đây, chất nền Luciferase DNA sẽ giải mã và

đẩy các Hsp90 (heat shock protein 90 kD) trong các phức Dioxin - AhR ra ngoài và các Hsp90 có khả năng phát sáng và sẽ được ghi nhận lại cường độ. Từ đó, tính toán ra nồng độ

DXN trong mẫu.

1. Chuẩn bị 10 ống eppendorf, hút 100uL DMSO vào mỗi ống. (Đường chuẩn) Hút 100uL chuẩn gốc vào STD0 (mix) sau đó hút 100uL từ ống đựng chuẩn STD0 sang STD1 (mix).Tiến hành lần lượt cho đến STD10. (Blank = DMSO)

Chú ý: Đối với mẫu chỉ có thể lấy ≤ 10uL ( vì thể tích mỗi well của plate và bộ kit chỉ là

400uL). Với mẫu có nồng độ cao phải pha loãng mẫu trước (hệ số pha loãng có thể là 1:5:25 hoặc 1:25:125) để đảm bảo có thể đo được.

2. Chuẩn bị pha loãng trung gian

- Media: Lấy từ tủ lạnh ngâm với nước nóng 370C trong 1h (phải thay nước trong bồn hàng ngày hoặc trước khi dùng để ngâm)

- Xịt 70% EtOH khử trùng bên ngoài lọ Media + lọ 50mL PBS

- Dùng pipet tròn loại 10mL (có 5 nấc, nấc 1 tương ứng với 200uL, mỗi nấc tăng 200uL).

Dùng pipet kéo lên đẩy xuống 6 lần để mix dd Media đã được chuẩn bị. Sau đó hút 400uL vào mỗi giếng theo bảng (add vào well màu xanh)

- Đậy plate bằng giấy nhôm

- Lấy bộ kit ra, đưa vào tủ hút, mở phần nilon đậy ở trong bỏ đi và đậy nắp lại. Chuyển bộ

kit trở lại vào vali, ủ bằng 1 gói CO2 (trong khoảng từ 2-3h).

3. Quy trinh chuẩn bị mẫu cho thử nghiệm

- Thêm 24uL DMSO vào các giếng pha loãng 1 và 2, sử dụng pipet 100uL - Thêm 6uL mẫu phân tích vào giếng pha loãng 1, sử dụng pipet 20uL

- Dùng pipet mix dung môi trong giếng pha loãng 1 và hút 6uL dung dịch ở đây sang giếng pha loãng 2 và mix lại, sử dụng pipet 20uL

- Lập lại quá trình như trên với các mẫu phân tích khác như bảng sau

Stock 1) - 2) Sample 6uL 3) - Dilution 1 2) DMSO 24uL 2) Sample 6uL 3) -

Dilution 2 3) DMSO 24uL 2) - 3) Dilution (1) 6uL

4. Thể vẩn của mẫu phân tích và màng Media

1) TCDD STD(S1-S9) 2) Testing sample 4uL

- Thêm 4uL DMSO vào vị trí DMSO (blank) và 4uL chuẩn TCDD đã chuẩn bị ở trên vào các vị trí S1-S9 mà mẫu QC như hình vẽ phần well mầu vàng.

- Dùng pipet 8 chip hút mẫu từ plate đã chuẩn bị ở bước trên sang phần well mầu xanh như hình vẽ.

5. Màng cell (Kit plate) (phải chuẩn bị trong tủ khử trùng – clean bench: bằng 70% EtOH)

- Loại bỏ tế bào hoạt hóa Calux từ môi trường nuôi cấy di động.

- Trải giấy nhôm sau đó lót giấy sạch thấm dung môi, để loại bỏ tất cả dd media trong khay tế bào bằng cách đổ chúng ra giấy thấm đã được chuẩn bị trước.

- Chuyển đường chuẩn đã được chuẩn bị và mẫu phân tích sang màng cell (Kit plate) vừa được chuẩn bị ở trên.

- Đậy nắp Kit plate và chuyển vào box ủ di động và đậy chặt lại. Loại bỏ gói sinh khí CO2

khỏi box để hoạt hóa Kit plate. Đặt box trong bồn nước 370C trong khoảng từ 19-24h.

6. Chuẩn bị thử nghiệm cơ chất của enzym oxi hóa (luciferase assay substrate)

- Hút 10uL luciferase assay buffer

- Chuẩn bị lysis solvent: pha loãng (1:5) bằng nước deion. (hút từ lọ cell culture lysis reagent 5X – dung môi nhớt và khó hút nên sau khi thả hoàn toàn pipet phải đợi khoảng 10s để dung dịch từ từ chuyển động lên tip)

- Dùng 50uL PBS để rửa tế bào và các tế bào không phản ứng trong các well của kit plate.

Sau đó loại bỏ hoàn toàn PBS ra khỏi plate.

- Dán tấm chắn vào mặt dưới plate (tránh sự truyền quang)

- Dùng pipet 8 hút 30uL dung dịch tế bào phân giải vào vị trí các well đã xử lý.

- Lắc nhẹ trong 10 phút bằng máy lắc plate.

Đo máy và xử lý số liệu trên excel Đường chuẩn: