Phương pháp nghi n cứu - nghiên cứu sản xuất chế p- 123docz.net

2.2.1.1. ác đ nh độ ẩm của phế thải chăn nuôi trước và sau xử lý theo TCVN 4326:2001. X ấ [39]

2.2.1.2. ác đ nh pH [23]

H ủ ế ả ă ử ý ế : C 10 100 50 KC 1N ả 30 K+ tha ế H+ ế 2 q ấ ấ ằ H .

2.2.1.3. ác đ nh hàm lượng cacbon hữu cơ [23]

C ủ ế ả ă ử ý ế : O ằ K2Cr2O7 H2SO4 ổ 145-1550C 30 N S 1975 A I 1989 . S K2Cr2O7 ằ F SO4.

2.2.1.4. ác đ nh hàm lượng nitơ tổng số [23]

N ổ ố ủ ế ả ă ử ý ế : H ổ ố Kj . C ạ sunf ả NH3 ằ ấ NH3 ằ acid boric.

2.2.1.5. ác đ nh hàm lượng P2O5 hữu hiệu [23]

H P2O5 ủ ế ả ă ử ý ế : P ấ phospho ằ a . X ấ ổ ố. H ủ ấ phospho ổ ố phospho phospho .

2.2.1.6. Phương pháp xác đ nh hàm lượng kali [23]

H K2O ủ ế ả ă ử ý ế : H ạ ằ HC 0 05 N . X ằ q ế ử .

2.2.2. P ươ á u v s v t

2.2.2.1. Đ nh lượng mật độ vi sinh vật theo TCVN 4884-2005 - P ĩ ạ . Kỹ ế ạ 30 C [36]

2.2.2.2. Kiểm tra mật độ xạ khuẩn : K G ế 2.2.2.1.

- K ạ ả C CMC ế ủ: C ủ ấ tr ạ ĩ G CMC ặ . K ạ ạ ả ặ i ấ ả ụ ủ ố ử .

2.2.2.3. Kiểm tra Salmonella theo TCVN 4829-2005 - P Salmonella ĩ ạ [37].

2.2.2.4. Kiểm tra mật độ Coliforms theo TCVN 4882-2007- P Coliforms. Kỹ ế ố ấ ấ [38].

30 2.2.2.5. ác đ nh trứng giun [18]

Lấ 100 ố ế ả 2/3 ố . ổ ầ N OH 0 5% ầ ố q ấ ả 30 . ố ố 1000-1500 / . Lấ ố ổ . ổ N NO3 ố ế ụ q ấ ỹ 10 ố 1000 / 5 . Lấ ố . ổ N NO3 ầ ố ế ặ ố . ố ặ tr 20 .

N ấ ố . N 1 g 50% ủ . ứ 10 q ế 40 . ế ố ứ ả ặ ặ ủ ứ . Kế q ả ố ứ 100 . X ấ ứ ố ằ ế ứ .

2.2.3. P ươ á á đị t tí â e u se, t bột á u [34]

2.2.3.1. Đ nh tính

Ng : D ấ enzym ạ ĩ [62, 63]

a. X ạ ả ủ ạ : enzym cellulase ỷ CMC ẽ ạ ỷ q ụ ằ .

P ế ụ :

 C 1 g CMC, 15 g agar trong 1000 m ấ ử .

 ổ 1 5 cm.

 D ụ ụ ụ 10 ứ CMC.

 N 0 1 enzym ụ . S ủ ạ 6-8 enzym ế . C ủ ấ 370C enzym ụ ấ CMC.

 C 5 C 2 KI 1 g I2 300 ấ ặ ạ ả 15 . S ạ ế q ế .

 CMC ả q .

H ạ CMC- ằ ố ả D .

b, X ạ ả ằ ế ạ ĩ ế ạ ả CMC ằ .

2.2.3.2. Khả năng phân giải cellulose, tinh bột trong phế thải chăn nuôi lợn

Thay ầ ằ ế ả ă q ổ 100 ế ả ă ứ 30 . Xạ ố ổ ầ i ố 150 / 72 .

- Công thức đối chứng: T ứ ổ ạ .

á đị à ư e u se, t bột ò t e t e ươ á sau:

a, Đ nh lượng tinh bột:

D ủ ằ . S ạ ố 0 9 .

(C6H10O5)n + n H2O → C6H12O6 T ế :

+ C 1-2 ứ ả 200-250 mg tinh b ấ 100 L 50 L ấ 30-45 .

+ L q ấ ử ặ ằ ấ 2-3 ầ . C ủ ấ ứ 25 L HC 5%. ủ q ố 3-5 .

+ S ủ ạ . T ằ N OH 0 5 % ế H 5 6-6 0 ử ằ ấ q .

+ C ứ 100 L. K ử ạ ằ P CH3COO)2 30% ạ ố ằ 20 N 2SO4 . T ấ ế ạ .

+ ằ .

+ T ế q ả

H ứ : X =

V1 x m a x V x 100 x 0,9

X- ằ %

a- ố ả ứ ố KM O4 ố L KM O4 .

V1: ấ ử V : 100 L

33 0 9: ố ổ b, Đ nh lượng cellulose:

N : ấ ủ ố ụ ủ ạ ạ ủ ụ ủ ế .C ấ è ... ố ụ ủ ả ử ý .

H ấ

- D N OH 0 5%

- D N C 0 5%

- D HC 10%

- D j T ế

C 1-2 200 L N OH 0 5% ố 30 . C ý .

L q ấ ế ặ . Rử ặ ạ N OH 0 5% . T ế ụ ặ ụ 10 HC 10%. T 10 ấ . 5 q ấ ế ặ . C ặ ạ ế ụ ụ ạ N OH 0 5% 40oC. . L ế 1-2 ầ . S ử ạ ỹ ằ . Sấ .

T ế q ả

H ứ : X% =

m a x 100

T :

34 :

2.2.4. Phươ á đá á ịu ệt á u [13]

X ả ă ủ ạ : c ủ ạ ấ ạ ĩ G : 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC.

Quan ạ ặ ạ ạ ố ứ ấ 30oC).

2.2.5. P ươ á á đị t á u [13]

- Trên môi trường đặc hiệu: ấ ạ ủ ạ ạ ĩ q ả ă ủ ạ ầ ế ạ ấ ạ .

- Khả năng tồn tại trên chất mang: Xạ ố ẽ G ử . X ạ ấ ạ ạ ấ ủ ạ ẻ 2.2.2.2.

+ X ạ ủ ạ ổ .

+ X ả ă ả cellulo ổ .

2.2.6. á đị độ t à á u - độ t à s ọ á u :

C ủ ạ ế ằ ỹ ử 16S DNA ấ . ố ế ủ

ủ C ứ ủ ủ ạ ử ụ ứ .

- Đị t á u [65]

X ằ ạ ử ả ạ gene 16 ARN ủ ủ ứ ẵ gene q ố ế EM L ằ FASTA 33 ạ ế ủ . Cặ ế ế ạ gene m 16 ARN ủ ủ E.coli J01695 ứ 15-33 1548-1532 . T ủ ủ ứ ả A I- 377 ủ H P -E Mỹ ử ý ằ S qE 1.03 A LIGN 1.9 M V 6.5.3 O f M I . ế ạ V V C S - ạ Q ố H N . T N Gene ằ E z/ / ế gene 16 ARN ủ . S ố ế ử ý ố ủ ấ ả ằ GENDOC2.5.

T ầ ằ ử ụ ủ ấ N Gene ả ố 11 q GENDOC 2.5. T s ấ ấ .

a. Phương pháp PCR thông thường (đơn):

Nguy n tắc: ổ ạ DNA ạ enzym T q ặ ủ NTP M 2+

Mồi: M I ấ . Thành phần cho phản ứng PCR b o gồm:

H2O 13,5

13,5 l

Buffer 10x 2,5 l

MgCl2 25mM 1,5 l

dNTP 2mM 2,5 l

Primer F10M 1,0 l

Primer R10M 1,0 l

Taq Gold polymerase (1,5 U/l)

1,0 l

DNA 2,0 l

Tổ 25,0 l

25,0 l Chu trình nhiệt cho phản ứng:

T ặ ả ủ ặ ặ ế ế ả ứ PCR. M ả ứ PCR ử ụ :

94 0C : 3 94 0C : 30 500C - 650C: 1 680C - 720C: 1 680C - 72 0C: 10 4 oC : Kế

Phương pháp điện di DNA tr n ge g rose 1%:

Nguyên tắc: ạ H DNA P ủ 1 ử DNA ẽ . Trình tự tiến hành: ả ấ 5 ả 1l ả L D ế 4

DNA 1 ạ . T ế T – acetate – EDTA (TAE) 1X ế 100V 30 ằ E 5 . Kế q ả q ụ ả G -DOC.

b. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR :

Lặ ạ 35

ằ ế ả PCR ầ ế ạ ả . C ạ q ủ kit Bioneer):

- ầ ạ

- N ả è UV . C ố f. T G ff 5 VGB: 1 Vgel 100 ≈ 100 à )

- Ủ 600C ế ế

- S ế ẽ . Nế ặ ầ ổ 10 à CH3COON 3M ẽ .

- T 1 ầ - ặ ố 2

- H DNA ý ấ q 750 à ế ả 1 ầ 10.000 / 2 .

- è ạ .

- T 500 à G ạ .

- ử 2 ầ ằ W ff W ằ ố 5 ầ ầ 500 à . 5 ạ .

- N ấ ặ ố f 1 5 .

- T 35à E ff EL . 5-10 13.000 / 2 ố f 1 5 -20 0C.

S ạ ả PCR ạ garose 1 5% TAE 1X.

c. Phương pháp tách dòng và xác đ nh trình tự gen :

38 Phương pháp tách dòng

 T ự ệ :

Sả PCR ầ A ố CR TOPO 2.1 ẵ ầ T . T ầ ả ứ CR TOPO 2.1 ả PCR H2O ử 10 ố ầ ả ứ ủ 3 ả PCR ẽ TOPO 2.1.

 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào hả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.

Nguyên tắc biến nạp: M ế ụ ủ C C 2 ố ạ ử DNA ạ ế ả ế . S ế ụ ổ ố ố . C ế ạ X-gal, IPTG . Sả ủ ả ứ ế ạ ế ả ế E. coli DH5 ằ ố . Tế ả ế K ủ ạ ạ ằ ỹ PCR ặ SP6 T7.

Các bước tiến hành:

- Lấ 4à ả ứ ố ế DH5α- T1 ế ả ế . 45 . C ý ấ ẹ ế .

- Số 42oC 45 ủ . Lấ ặ 2 .

- T ố 100à SOC ặ ủ 200-220 / 37oC trong 1 .

- T ả ĩ A - plate. Cấ ả 10à ế ĩ L L ặ ổ K 40à / X-gal.

- ặ ủ ủ 37oC q 20-22 .

- C ạ ố ấ ạ 5 L ứ K X- ấ 37oC qua .

Tách P smid ADN

Nguyên tắc: C ạ ổ L K ă ố ADN ằ K .

Các bước tiến hành:

- Ly 3000 / 5 5 ố E. coli ổ ố .

- T 250 à RS ff ố .

- T 250 à L ff ế ằ 3-4 ầ . - T 350 à NE ff ế ụ ằ 3-4 ầ .

- L 13.000 / 4oC 10 .

- C 13.000 / 1 .

- T 500 à DE ff 5 13.000 / trong 1 ph

- N ấ DNA 2 . T 700 à WP ff 13.000 / 1 .

- L ằ 13.000 / 1 - C DNA ố 1 5 .

- T 50à EL ff 1 DNA ế .

- L 13000 / 1 DNA P .

 Kiểm tr ADN p smid bằng phương pháp co ony PCR

S ế ạ ế ấ ế ạ ả ứ PCR ặ SP6 T7. Dụ ả PCR ế ế ạ ạ ADN ố .

Phương pháp tiến hành:

D ầ ă ấ ầ ố ạ ầ ả ứ PCR ầ :

T ầ ả ứ PCR 1 ả ứ S A đ F PCR M M 8à

M S 6 1 à

M T7 1 à

N ấ 10 à

Tổ 20 à

Chu trình nhiệt cho phản ứng:

94 0C : 3 94 0C : 45 500C : 30 720C : 1 5 720C : 10 4 oC : Kế .

Sả PCR ạ 1 5% TAE 1X.

Lặ ạ 30

41 Phương pháp giải trình tự gen:

P ổ ạ 1 ạ . N ủ ằ q ổ ế. S q ả ằ ABI-377 ủ H Perkin-E Mỹ ử ý ằ S qE 1.03 A LIGN 1.9 M V 6.5.3 O f M I . . T ế ạ T C S - ạ Q ố H N .

e. Phương pháp tin sinh học (sử dụng phần mềm NCBI, EBI, Expasy…):

T N G ằ E z/ / ế 16 ARN ủ . S ố ế ử ý ố ủ ấ ả ằ GENDOC 2.5. T ầ ằ ử ụ ủ .

2.2.7. P ươ á đá á á đ ều ệ ưở đ quá trì e [69]

2.2.7.1. ôi trường lên men sinh khối

C ử ụ ứ ố ầ ố ủ ủ ạ ầ ế ạ ấ ẻ ẵ ạ V N . C ủ ạ ố ấ 1 G ầ ế ấ ỷ 5% .

+ M ố ủ ạ : M ố ứ

(Gause)

M ả ấ SX1

M ả ất SX2

M ả ấ SX3 T : 20 g R : 20 N ế : 40 Pepton : 20 g

42 KH2PO4: 0,5 g

MgSO4.7H2O: 0,5 g KNO3 :1,0 g

NaCl : 0,5 g FeSO4 : 0,01 g N ấ :1000 ml pH = 6,8-7,2

ấ : 10 K2HPO4: 0,2 g N ạ : 1000

Glucose: 5 g ấ : 5

N ạ : 1000

ấ : 10 Glucose: 1 g

N ạ : 1000

* Các thành phần trong môi trường chuẩn b theo công thức trên và khử tr ng 15 ph t ở áp suất 1 at (121oC) .

- T ố ỹ ử ụ ứ : + N q ố : 30oC + T : 72 .

+ L ấ : 0 70 3 / / .

M ối p khi m tế ạ nh 2.2.2.2 ấ ạ c của xạ khu nh 2.2.3.1 ải ổ nh

2.2.7.2. nh hưởng của nhiệt độ

+ M ấ : ử ụ ế q ả ứ ủ ạ 2.2.7.1.

+ Tỷ ố ấ 1: 5% ố ấ 1 ố G ố 150 / 48 ả ả ế 108 CFU/ml.

+ pH: 7,0

+ L ấ : 0 7 3 / / . + T : 48 .

+ N q ố ứ : 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC.

Nhi ối tố tế ạ nh theo 2.2.2.2 ấ ạ c của xạ khu nh theo 2.2.3.1 ải ổ nh.

2.2.7.3. nh hưởng của pH

+ M ấ : ử ụ ế q ả ứ ủ ạ 2.2.6.1.

+ Tỷ ố ấ 1: 5% ố ấ 1 ố G ố 150 / 48 ả ả ế 108 CFU/ml.

+ L ấ : 0 7 3 / / . + T : 48 .

+ N q ố : ử ụ ế q ả ứ ủ ạ 2.2.6.2.

pH u ch nh ức 5,0; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8.

pH ng ố tế ạ 2.2.2.2 ấ ạ c của xạ khu 2.2.3.1 ải ổ nh.

2 2.7.4. Tỷ lệ giống cấp 1

+ M ấ : ử ụ ế q ả ứ ủ ạ 2.2.6.1.

+ L ấ : 0 7 3 / / . + T : 48

+ N q ố : ử ụ ế q ả ứ ủ ạ 2.2.6.2.

pH: ử ụ ế q ả ứ H ủ ạ 2.2.6.3.

+ Tỷ ố ấ 1: ổ ứ 0 5; 1; 2; 3; 4; 5%.

G ố ấ 1 G ầ ế ế 108 CFU/ml.

Tỷ ố ấ 1 ố tế ạ 2.2.2.2 ấ ạ c của xạ khu nh theo 2.2.3.1 ải ổ nh.

2.2.8. Kỹ t u t s u t [69]

ả ấ ế ạ ế ế q ả ứ ỹ ả ấ ế ố : “Nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật xử lý nhanh phế thải chăn nuôi”do H H ủ [13]. C ấ ử ụ ứ ạ 0 1 ử ụ CaCO3 ỷ 0 5% H ử ằ nhi t 170o C ến 180o C trong th 1 .

- ác đ nh tỷ lệ phối trộn các chủng xạ khuẩn: hủ ạ ố ỷ 1:1:1 1:2:1 1:2:2 2:1:2 2:2:1 ố ấ ỷ 10%.

Tỷ tế ạ nh theo 2.2.2.2 ấ ạ c của xạ khu nh theo 2.2.3.1 ổ 0 7 15 1 2 3 .

- ác đ nh tỷ lệ phối trộn h n hợp d ch sinh khối các chủng xạ khuẩn với than b n: ố ố ấ ỷ 5/100;

10/100, 15/100 20/100.

Tỷ ố tế ạ 2.2.2.2 ấ ạt c của xạ khu

2.2.3.1 ổ 0 7 15 1 2 3 .

- Bảo quản sản phẩm

Sả ố ấ ẹ 40oC i gian 3-4 ố ả q ả . Sả ả q ả 0 7 15 30 45 60 75 ...

2.2.9. P ươ á t í ệ s u [13]

- Nguyên liệu: P ạ

C ế VSV: ế ạ 108 CFU/g) ạ ặ f .

Super phosphat - C t t í ệ :

+ T ố 2 ứ ứ ặ ạ 3 ầ .

Chuẩn b nguyên liệu: P ế ả ă ử ụ q ử ý ấ ặ ả ử ý ạ . T q ử ý ố ế ặ ế ụ ạ .. ụ ả ầ . N ổ ầ ử ý ấ ố . Tỷ ố ả 20-30%. Nế H ấ ầ ổ C CO3 ặ H ạ 6 5÷7 5.

T ế ố 1 ấ / ứ ố ủ :

N ằ ế ặ ủ .

Chuẩn b d ch xạ khuẩn: D ạ ử ụ ử ý 1 ấ ế ế ứ :

Nguy n, vật iệu Đơn vị tính Số ượng C ế ạ ả ả

ế 108 CFU/g) kg 1

R ng kg 0 2÷0 3

N ạ 10÷15

D ạ ế ế : T ầ ứ ứ : ế ạ .

Phối trộn nguyên liệu và dung d ch xạ khuẩn: Sử ụ n ầ , ử ụ ố ẻ ả .

Ủ nguyên liệu: H ố 50-55%

ế ủ ạ ố ủ 100 .

TT Nguy n, vật iệu Đơn vị tính Số ượng

1 P ế ả ă kg 700÷ 800

2 N

ế ụ kg 200÷300

3 Super photphat kg 5,0

4 ạ ặ f kg 1,0

5 V kg 5,0

K ứ , ủ ế . S 5 ế ả ố ủ ằ ế ả ặ ả ả ủ ố ấ . T õ ế ạ ủ ố ủ q ả ổ ụ ố ủ . P ế ả ă ử ý ằ ế ạ ả ả ụ ủ ố ố 0 5 oC.

- Công thức đối chứng: T ứ ổ ế ạ .

- Các chỉ tiêu khảo sát nghiên cứu: T q ủ ế õ ế q ầ ố ủ. C ý ả q ủ .

2.2.10. P ươ á đá á độ và s à ơ t tr ây â HC H b t t u [59, 60, 61, 69, 77].

- Đánh giá độ hoai mục của nguyên liệu theo TCVN 7185: 2002

Sử ụ ế ứ 0oC ế 100oC 50 ế 60 ố 10 . S 15 ầ ứ ấ . õ ổ 3 ế ầ 9 ặ 10 . P ả ả ụ ổ q 0 5oC ố õ .

- Khả năng sử dụng làm cơ chất trồng cây của phân HCSH chế biến t phế thải chăn nuôi lợn:

- Phương pháp trồng cây (plant test) [59, 60, 61, 69, 77]

C 38 28 6 ổ ầ ủ 10 ạ ả ặ . S ủ ặ ả ầ . T õ q ủ ủ ủ. S 5 ế ạ ố ủ ả

. Mứ ủ ố ủ q ả ầ ủ ả . K ố ả 60- 100 ẽ ế ố ủ . Nế ố ủ ả 60 ứ ủ .

- Phương pháp thử khả năng nảy mầm hạt cải [69]

T ế : C 10 HCSH ế ế ế ả ă 250 ổ 200 ấ ả 30 2 q ấ ấ .

Sử ụ q ạ ố ả 2 ạ ả ỷ ả ầ .

2.2.11. P ươ á t í ệ đ ruộ

P HCSH ả ấ ế ả ă q ả ố ố ạ : q TCVN 216-2005 : Q ạ ả ủ ố .

- P ố . - Số ầ ặ : 3 ầ .

D : 20 2

1. T q ả ủ HCSH ố ố T 7 2 ụ ụ ụ ă 2009 ạ Hả T Hả H N .

M ấ : 45 / 2

- C ứ : 4 ứ .

CT1: 100% NPK + 5 ấ HCSH ế ế .

CT2: 75% NP + 100% K + 5 ấ HCSH ế ế . CT3: 50% NP + 100% K + 5 ấ HCSH ế ế . CT4 C : N 100% NPK + 5 ấ .

NPK: 60:90:60

C õ : ố / ố / ỷ ạ / ố 1000 ạ ă ấ ý ế ă ấ .

Số ử ý ố ằ ầ I 4.0.

2. T q ả ủ HCSH ố ả tạ ạ V N i - A – H N i trong hai vụ è ụ thu ă 2009.

- C ứ : 4 ứ ứ ạ 3 ầ 1 = 40 2

+ CT1: 100% NPK + 5 ấ ế ế . + CT2: 75% NP + 100% K + 5 ấ HCSH ế ế . + CT3: 50% NP + 100% K + 5 ấ HCSH ế ế . + CT4 C : N 100% NPK + 5 ấ

+ NPK: 60:30:30

C õ : ả ầ ạ ă ấ ý ế ă ấ .

Số ử ý ố ằ ầ I 4.0.

3. T q ả ủ HCSH ố ố ă 2010 ạ E – .

- C ứ : 4 ứ ứ ạ 3 ầ 1 = 200 2.

+ CT1: 100% NPK + 5 ấ ế ế .

+ CT2: 75% NP + 100% K + 5 ấ ế ế . + CT3: 50% NP + 100% K + 5 ấ ế ế . + CT4 C : N 100% NPK + 5 ấ .

+ NPK: 200:150:200

C õ : ỷ / % 18 % 16 ă ấ ý ế ă ấ .

Số ử ý ố ằ ầ I 4.0.