CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Các phương pháp phân tích
2.6.1 Xác định độ ẩm dư [f]
a. Mục đích
Đo độ ẩm trong nguyên liệu thí nghiệm nhằm xác định hoạt tính chống ôxy hóa và hàm lượng polyphenol tổng trong các mẫu khô (khô tuyệt đối) từ các mẫu thô ban đầu.
Khi đó, việc so sánh kết quả giữa các mẫu có ý nghĩa hơn.
b. Nguyên tắc
Dưới tác dụng của nhiệt độ, nước trong nguyên liệu bay hơi dần cho đến khi đạt độ ẩm không đổi. Dựa vào sự chênh lệch khối lượng của nguyên liệu trước và sau khi tách ẩm để xác định hàm lượng ẩm trong nguyên liệu.
c. Cách đo độ ẩm dư
Dùng tủ sấy không khí nóng. Sấy cốc trong vòng 45 phút ở 100 -1050C, sau đó đặt vào bình hút ẩm 15 phút. Cân và ghi lại khối lượng của cốc (mcốc).
Cho 1 g mẫu vào cốc. Sấy cả cốc và mẫu qua đêm (12-15 tiếng). Sau đó, đặt vào bình hút ẩm 15 phút. Cân cả cốc lẫn mẫu và ghi lại số liệu (mcốc+mẫu).
Lượng chất khô = m cốc+mẫu sau khi sấy − m cốc
m mẫu ban đầu * 100 (%) Độ ẩm dư = 100 – hàm lượng chất khô (%)
2.6.2 Phân tích hàm lượng phenolics tổng số (TPC) [7]
a. Hóa chất
Thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% (v/v) Dung dịch Na2CO3 7,5% (w/v)
Chất chuẩn: acid galic với các nồng độ: 20, 40, 60, 80, 100 (g/ml).
b. Cách tiến hành
TPC của dịch chiết từ vỏ quả cacao được xác định sử dụng phương pháp Folin- Ciocalteu. Cụ thể, 0,5 ml dịch chiết được pha loãng 2 lần trong nước trộn với 2,5 ml chất thử Folin-Ciocalteu 10% (v/v). Hỗn hợp được để yên trong 6 phút. Sau đó, thêm vào 2 ml dung dịch Na2CO3 7,5% (w/v). Hỗn hợp được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sự hấp thụ của hỗn hợp được đo tại 765 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS. Nước và acid galic được sử dụng làm chất đối chứng và chất chuẩn. TPC được thể hiện tương đương bằng mg gallic acid/g mẫu khô (mg GAE/g mẫu khô).
Phản ứng của mẫu chuẩn: 0,5 ml dung dịch chuẩn là acid gallic ở các nồng độ: 20, 40, 60, 80, 100 (g/ml) + 2,5 ml chất thử Folin-Ciocalteu 10% (v/v) + 2 ml dung dịch Na2CO3 7,5% (w/v).
Phản ứng của mẫu trắng: 0,5 ml nước + 2,5 ml chất thử Folin-Ciocalteu 10% (v/v) + 2 ml dung dịch Na2CO3 7,5% (w/v).
Tất cả các mẫu đều được đo ở bước sóng 765 nm.
c. Công thức tính
Từ kết quả đo dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn acid galic y = f(x) với y là mật độ quang, x là nồng độ chất chuẩn (g acid galic/ml). Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ acid galic trong mẫu đo M (g acid gallic/ml). Hàm lượng phenolics trong nguyên liệu được tính như sau:
TPC = 𝑀.𝑓.𝑉
Độ ẩ𝑚 𝑑ư.1000
TPC: Hàm lượng phenolics tổng trong nguyên liệu (mg GAE/g chất khô).
M: Hàm lượng phenolics trong mẫu đo (g acid galic/ml).
f: Hệ số pha loãng.
V: Thể tích dung dịch sau trích ly phenolics (ml) Độ ẩm dư (%)
2.6.3 Xác định hiệu suất trích ly phenolics (PEE) [7]
Hiệu suất trích ly phenolics được xác định bằng cách: Lấy điều kiện mà mẫu có hàm lượng phenolics tổng số cao nhất trong 27 thí nghiệm. Trong điều kiện này, 1 g mẫu khô được trích ly liên tục 5 lần, sau mỗi lần, dùng máy ly tâm để thu dịch chiết và đo tổng thể tích dịch chiết thu được. Mẫu này được gọi là mẫu control. Tiến hành đo hàm lượng phenolics có trong mẫu control.
Hiệu suất trích ly phenolics được tính theo công thức:
PEE = 𝑇𝑃𝐶
𝑇𝑃𝐶 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 . 100 (%) PEE: Hiệu suất trích ly phenolics (%).
TPC: Hàm lượng phenolics có trong mẫu đo (mg acid galic/g chất khô).
TPCcontrol: Hàm lượng phenolics có trong mẫu control (mg acid galic/g chất khô).
2.6.4 Phân tích hàm lượng saponin tổng số (SC) [7]
a. Hóa chất:
Dung dịch vanilin 8% (w/v) Dung dịch H2SO4 72% (v/v) b. Cách tiến hành
Hàm lượng saponin của dịch chiết từ vỏ quả cacao được xác định như sau:
0,25 ml dịch chiết trộn với 0,25 ml dung dịch vanilin 8% (w/v). Sau đó, thêm vào 2,5 ml dung dịch 72% H2SO4 (v/v). Hỗn hợp được ủ ở 700C trong 15 phút, sau đó được làm lạnh nhanh chóng bằng nước đến nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 560 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS. Methanol và escin được sử dụng như là chất đói chứng và chất chuẩn. Hàm lượng saponin được thể hiện tương đương bằng mg escin (EE)/g mẫu khô.
Phản ứng của mẫu chuẩn: 0,25 ml dung dịch chuẩn là escin với các nồng độ (50 - 400 g/ml) + 0.25 dung dịch vanilin 8% (w/v) + 2,5 ml dung dịch 72% H2SO4 (v/v).
Phản ứng của mẫu trắng: 0,25 ml methanol + 0.25 dung dịch vanilin 8% (w/v) + 2,5 ml dung dịch 72% H2SO4 (v/v).
Tất cả các mẫu được đo ở bước sóng 560nm.
c. Công thức tính
Từ kết quả đo mẫu chuẩn, dựng đường chuẩn escin y = f(x) với y là mật độ quang, x là nồng độ chất chuẩn (g acid galic/ml). Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ escin trong mẫu đo M (g escin/ml). Hàm lượng saponin trong mẫu được tính như sau:
SC = 𝑀.𝑓.𝑉
Độ ẩ𝑚 𝑑ư.1000
SC: Hàm lượng saponin tổng trong nguyên liệu (mg escin/g chất khô).
M: Hàm lượng saponin trong mẫu đo (g escin/ml).
f: Hệ số pha loãng.
V: Thể tích dung dịch sau trích ly saponin (ml).
Độ ẩm dư (%).
2.6.5 Khả năng quét gốc tự do DPPH [7]
- Pha dung dịch gốc (stock): Pha dung dịch gốc DPPH 0,024% trong methanol 100%, bảo quản ở -200C.
- Pha dung dịch phản ứng:
Pha loãng 10 ml dung dịch gốc DPPH 0.024% với 45 ml methanol 100% (tỉ lệ 1:4.5) để đạt độ hấp thụ 1.1 ± 002 ở 515 nm, bảo quản ở -180C.
Lấy 0.15 ml dịch chiết đã pha loãng 2 lần trộn với 2,850 ml dung dịch DPPH phản ứng vừa điều chế và tiến hành ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (21± 10C) trong 3h. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở 515 nm bằng máy do quang phổ UV-Vis.