Việc chuẩn bị kháng thể đa dòng đòi hỏi phải có kháng nguyên sạch. Còn kháng thể đơn dòng được sản xuất từ kháng nguyên chưa sạch. Các protein hòa tan lộ ra sự đáp ứng mạnh có thể biến hóa thành những kháng nguyên đặc thù bởi sự liên kết chúng với cơ chất rắn.
Axit nucleic bình thường không gây ra miễn dịch nhưng khi liên kết với protein mang nó thì sẽ gây ra miễn dịch. Cacbohydrat loại đơn giản thì thường có tính miễn dịch yếu và cần thiết liên kết với một protein mang nó. Carbohydrat càng lớn thì có thể gợi ra sự đáp ứng bình thường nhưng không gây ra đáp ứng thứ cấp. Kháng nguyên có thể được chuẩn bị bằng nhiều cách như: (i) nghiền phá huỷ các mô với những hạt thủy tinh hoặc (ii) tách chiết bằng các phân tử khi tủa muối hay chất tẩy rửa. Phương pháp được chọn phụ thuộc vào kháng nguyên hòa tan hay không hòa tan và thành phần của kháng nguyên là protein, cacbohydrat hay axit nucleic. Các kháng nguyên đó có thể được tách chiết và làm sạch theo trọng lượng của chúng hoặc theo kích thước thông qua quá trình điện di trên gel.
2. Sản xuất kháng thể đa dòng
Các kháng thể đa dòng được tạo nên bằng cách tiêm chất gây miễn dịch (kháng nguyên) vào sinh vật và sau một thời gian thích hợp thì sẽ tách huyết thanh tương ứng. Sự đáp ứng miễn dịch sẽ phụ thuộc vào lượng và bản chất kháng nguyên cũng như khả năng đáp ứng miễn dịch của vật được tiêm với kháng nguyên đó. Thông thường, trong lần tiêm đầu tiên thì kháng thể sinh ra chứa IgM với nồng độ rất thấp, lần tiêm thứ hai thì nồng độ kháng thể IgG đạt ở mức trung bình. Tuy nhiên, trong những lần kế tiếp sẽ làm tăng nồng độ của kháng thể IgG đáng kể.
a. Chuẩn bị hỗn hợp tá dược kháng nguyên
Kháng nguyên được trộn với tá dược trước khi tiêm với mục đích là làm cho kháng nguyên giải phóng từ từ để kích thích hệ thống sinh miễn dịch của sinh vật. Để chuẩn bị tá dược kháng nguyên thì thường trộn dung dịch kháng nguyên với tá dược Freund tương đương với nhau. Ngoài tá dược Freund thì cũng có thể dùng một số khác như Titermax với liều 50500ml/động vật. Tuy nhiên, với những tế bào sống thì không cần thiết phải bổ sung tá dược . b.Con đường gây miễn dịch
Phương pháp chung thường là gây miễn dịch cho thỏ là tiêm dưới da bởi vì một lượng lớn có thể tiêm vào động vật và kháng thể đặc hiệu có thể được dẫn qua bởi phương pháp này. Tiêm tĩnh mạch đã được thử trên thỏ, sự đáp ứng nhanh và mạnh bởi vì kháng nguyên đi vào máu và nhanh chóng tới các cơ quan sinh miễn sinh như lách, gan và phổi. Tuy nhiên, tiêm tĩnh mạch không thích hợp lắm trong lần tiêm đầu tiên vì kháng nguyên đặc hiệu dễ bị loại trừ bởi những chất hóa học thô như azide sodium đi qua đường phổi.
3. Sản xuất kháng thể đơn dòng
Huyết thanh chứa một dãy các kháng thể và chúng đặc hiệu với các kháng nguyên khác nhau. Khi động vật được gây miễn dịch thì khoảng 1/10 kháng thể tuần hoàn đặc hiệu với kháng nguyên. Các kháng thể được sản xuất bởi tương bào từ tế bào B được biệt hóa. Mỗi tế bào B bố mẹ có khả năng sản xuất các kháng thể đặc hiệu. Các kháng thể được bài tiết bởi dòng tế bào lympho B thì giống hệt nhau và đây cũng là nguồn gốc của các tế bào đồng nhất.
Song các tế bào tương bào có đời sống tương đối ngắn và cũng không thể lớn lên được trong nuôi cấy.
Năm 1975, Kohler và Milstein đã phát triển kỹ thuật cho phép tương bào được hòa vào các tế bào ung thư myeloma để tạo ra các tế bào lai và lớn lên. Các tế bào này có khả năng lớn lên không hạn chế mà vẫn sản xuất ra kháng thể đặc hiệu gọi là kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody- MAB). Các kháng thể đơn dòng có thể được sản xuất từ kháng nguyên không sạch bằng cách chọn lựa các dòng tế bào đơn giản sau khi hợp nhất. Chúng có thể được chuẩn bị để chống lại sự thay đổi rộng rãi các phân tử gây miễn dịch như protein, cacbohydrat, axit nucleic hoặc phối hợp giữa chúng. Các kháng thể đơn dòng được hình thành chỉ đặc hiệu với một yếu tố quyết định của phân tử gây miễn dịch. Vì thế, có thể được dùng để tách yếu tố quyết định ấy. Thêm vào đó dòng tế bào lai sẽ cung cấp một cách không hạn chế kháng thể trong dịch nổi của tế bào.
Hình 0.7. Sản suất kháng thể đơn dòng ở chuột
Nhiều dòng myeloma có thể được sản sinh bằng cách tiêm cho chuột dầu khoáng vào màng bụng. Dòng tế bào myeloma được chọn lựa rất kỹ là chúng không có kích thích hệ thống miễn dịch sinh ra kháng thể. Các tế bào lai có thể được chuẩn bị bởi sự hợp nhất tế bào myeloma và các tế bào sản xuất kháng thể mà các tế bào này được tách ra từ các loài chuột khác nhau. Tuy nhiên, thành công nhất là hai loại tế bào này đến từ một dòng chuột.
4. Làm sạch kháng thể
Có nhiều phương pháp làm sạch kháng thể (bảng 3.1) và sự lựa chọn chính xác phương pháp sẽ tùy thuộc vào số lượng các thay đổi về các loại kháng thể.
Bảng 0.1. Phương pháp làm sạch kháng thể
Kỹ thuật Phù hợp Ưu điểm Nhược điểm
Sunphat amon
Có ích cho việc đậm đặc và làm sạch một phần kháng thể từ tất cả các nguồn và các mẫu
Rẻ, đậm đặc, thuận tiện với một lượng lớn và dễ thực hiện
Tạo ra kháng thể chưa được sạch lắm, cần kết hợp với các phương pháp khác
Caprylic acid Hữu ích với IgG từ tất cả các nguồn và các mẫu
Rẻ, thuận tiện đối với một lượng lớn và cũng dễ làm
Tạo ra kháng thể không sạch và cần kết hợp với các kỹ thuật khác
DEAE Có ích cho việc đậm đặc và làm sạch một phần kháng thể tử tất cả các nguồn và các mẫu
Rẻ, thuận tiện đối với một lượng lớn và cũng dễ làm
Tạo ra kháng thể không sạch và cần kết hợp với các kỹ thuật khác
Hydroxyapti te
Có ích cho tất cả các kháng thể từ các nguồn
Đậm đặc, không thẩm tích kháng thể và kháng thể được phục hồi trong dạng dùng ngay
Sinh ra kháng thể không sạch lắm
Lọc gel Thích hợp cho IgM từ tất cả các nguồn
Tách IgM từ các kháng thể khác trong huyết thanh đa dòng
Khả năng thấp và cần pha loãng.
Kháng thể tạo ra không sạch.
Ammonium Ascites, polycloral Tạo kháng thể gần như sạch, rẻ và thuận tiện với lượng lớn
Trải qua nhiều giai đoạn.
Caprylic acid Sunphat amon
Ascites,
polyclonal sera
tạo ra kháng thể gần như sạch, rẻ và thuận tiện với lượng lớn
Trải qua nhiều giai đoạn.
Protein A IgG liên kết với protein A tử tất cả các nguồn
Tạo ra kháng thể sạch, các bước làm đơn giản và phù hợp với lượng lớn
Rất đắt tiền và không phù hợp cho tất cả các mẫu và các lớp
Cột ái lực kháng
Polyclonal sera Tạo ra kháng thể sạch và sản sinh ra kháng
Đắt tiền, tốn nhiều bước và đòihỏi
nguyên thể đặc hiệu kháng nguyên sạch Cột ái lực
chống Ig
Kháng thể chuột, cừu và dê. Kháng thể lớp dưới lớp đặc hiệu từ huyết thanh đơn dòng và kháng thể đơn dòng ở chuột
Tạo ra kháng lớp và mẫu đặc hiệu
Đắt và tốn nhiều bước.