Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất.
hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc và không hòa tan lẫn nhau: pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…). Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết một pha tĩnh có sự khác nhau là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Từ các đặc điểm trên mà người ta có thể tách các chất nhờ quá trình sắc ký.
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha dộng và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử đặc biệt langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần)
Trong đó:
n n α .bC 1+bC
nα
nhau như: sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký cột, sắc ký, sắc ký lớp mỏng,… Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tượng cần phân lập người ta lựa chọn những phương pháp sắc ký phù hợp.
1.3.3.1. Sắc ký cột
Sắc ký cột là phương pháp được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ từ nguồn tự nhiên. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150 μm), được nạp trên các cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phía bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Pha tĩnh được nạp lên cột sắc ký theo hai phương pháp khác nhau là nạp ướt hoặc nạp khô.
Phương pháp nạp khô, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
Phương pháp nạp ướt, chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết. Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột không bị nứt, gãy, dò.
1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) hay còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ. Trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ ví dụ:
silicagel, oxit alumin,… Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên trên nền phẳng như tấm kính hay tấm nhôm. Do chất hấp phụ được tráng
thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
Bình sắc ký: Một chậu, lọ bằng thủy tinh có nắp đậy.
Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25-0,5 nm của một loại hợp chất hấp phụ như silicagel, alumin được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên trên tấm kính, tấm nhôm. Chất hấp phụ trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một loại polymer hữu cơ.
Mẫu phân tích: Thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phải trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình.
Pha động: Dung môi hay hỗn hợp hai dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo bản mỏng và lôi kéo mẫu chất phân tích đi theo nó. Tùy theo khả năng hấp phụ - giải hấp phụ của mỗi chất mà chúng sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau và quãng đường khác nhau trên bản mỏng.
Phương pháp sắc ký lớp mỏng có ưu điểm là chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích, có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích, tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng.
Chính vì vậy với mục đích là phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký cột để phân lập các hợp chất hữu cơ người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng.