Kết quả phản ứng tiền chọn lọc AFLP

Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ

4.3. Kết quả phản ứng tiền chọn lọc AFLP

Kỹ thuật AFLP trải qua nhiều bước thực hiện. Mức độ thành công của những bước sau phụ thuộc rất nhiều vào thao tác và kết quả ở những bước trước đó. Do đó, kết quả của phản ứng tiền chọn lọc rất quan trọng vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả phân tích đa hình ở bước chọn lọc tiếp theo. Nguyên tắc của phương pháp AFLP là dựa trên độ đặc hiệu của các enzym cắt hạn chế đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA hệ gen. Sự khác biệt vị trí giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau. Do đó, để có được phổ diện các phân đoạn DNA lý tưởng, người ta thường dùng phối hợp cặp enzyme EcoRI - MseI hơn là phối hợp EcoRI - EcoRI hoặc MseI - MseI. Điều này còn liên quan đến việc thiết kế mồi và kỹ thuật khuếch đại.

Việc sử dụng các endonuclease để cắt DNA hệ gen là bước quan trọng trong kỹ thuật AFLP. Kỹ thuật AFLP chuẩn sử dụng kết hợp một cặp endonuclease gồm một enzyme cắt “hiếm” (rare cutter) và một enzyme cắt thường xuyên (frequent cutter). Enzyme cắt thường xuyên sẽ tạo ra các phân đoạn DNA kích thước nhỏ dễ dàng được khuếch đại. Trong khi đó, enzyme cắt “hiếm” làm hạn chế số lượng phân đoạn DNA được khuếch đại (Weising et al., 2005). Nhiều nghiên cứu thử nghiệm phối hợp các loại enzyme khác nhau cũng đã được thực hiện để đánh giá hiệu quả cắt DNA hệ gen trong kỹ thuật AFLP. Chẳng hạn: BglII - MfeI được sử dụng đối với loài Campylobacter jejuni và S. typhimurium, EcoRI - MseI đối với Salmonella

enterica, XbaI - MseI hoặc kết hợp cả ba enzyme XbaI - BsrGI - HinP1I đối với các chủng Salmonella (Lindstedt et al., 2000), hoặc phối hợp EcoRI với cặp HpaII- MspI (Weising et al., 2005)…

Việc lựa chọn các loại enzyme phù hợp để thực hiện kỹ thuật AFLP trong các nghiên cứu cụ thể phụ thuộc các yếu tố như chiều dài của trình tự nhận biết, tần số phân tách, chi phí, độ nhạy của enzyme đối với quá trình methyl hóa cytosine của trình tự đích và mục tiêu nghiên cứu. Sự phối hợp EcoRI - MseI được sử dụng phổ biến hơn cả trong phần lớn các nghiên cứu đánh giá đa hình (Weising et al., 2005).

Khi sử dụng cặp enzyme EcoRI - MseI chung với nhau, những enzym này sẽ tạo ra những đoạn DNA rất ngắn, chúng được khuếch đại khá tốt và đạt được kích thước phù hợp (<1Kb). Kết quả thu được của phản ứng tiền chọn lọc trong nghiên cứu này với các băng DNA nhỏ có kích thước từ 100 bp đến 1500 bp cũng chứng minh cho nhận định đó.

Kết quả của phản ứng tiền chọn lọc có thể được giải thích như sau: DNA tổng số được cắt bởi hai enzyme EcoRI và MseI thành những phân đoạn DNA nhỏ, sau đó chỉ những phân đoạn được cắt đồng thời bằng 2 enzyme này được gắn với cặp adaptor tương ứng của enzyme EcoRI và MseI, các phân đoạn này được khuếch đại chọn lọc bằng cặp mồi bắt cặp bổ sung với adaptor và mang một nucleotide chọn lọc nằm ngay sau trình tự nhận biết của enzyme cắt hạn chế. Sản phẩm của phản ứng tiền chọn lọc được hạn chế bởi việc dùng mồi tiền chọn lọc và thời gian kéo dài trong phản ứng PCR. Sự đa dạng các phân đoạn DNA thu được thể hiện ở dải băng DNA trên ảnh điện di phù hợp với kết quả dự kiến theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit. Sự đa dạng về kích thước các đoạn DNA làm tăng sự phong phú về số lượng khuôn đầu vào của phản ứng chọn lọc tiếp theo, đảm bảo cho tính đa hình các phân đoạn thu được.

Việc cắt DNA bằng cặp enzyme cắt hạn chế và gắn các đoạn DNA đã cắt với adaptor đặc hiệu là phần cơ bản của phản ứng tiền chọn lọc. Vì các adaptor được thiết kế gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt của enzyme nên mồi của phản ứng PCR tiền chọn lọc cũng được thiết kế dựa trên trình

tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại. Chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích. Phương pháp này tạo ra một lượng lớn các băng trong điện di, làm cho việc phát hiện thể đa hình thuận lợi hơn rất nhiều. Số lượng đoạn DNA được khuếch đại có thể được kiểm soát bằng cách chọn lọc base khác nhau và thành phần nucleotide trong adaptor.

4.4. ĐA HÌNH AFLP Ở CÁC QUẦN ĐÀN TÔM SÚ

Kết quả phân tích đa hình AFLP sử dụng cặp mồi chọn lọc MseI-CTT/EcoRI- ACC JOE đối với 60 mẫu tôm sú thuộc ba quần đàn BTB, NTB và NB với số lượng alen ở các quần đàn khác nhau, không có sự trùng nhau hoàn toàn về vị trí xuất hiện của các alen đã cho thấy hệ gen của các mẫu tôm sú có cấu trúc khác nhau, tức là có sự đa hình về mặt di truyền giữa các cá thể.

Tỷ lệ các alen phổ biến rất nhỏ (chỉ có 5 trong số 309 alen, chiếm ≈ 1,6% tổng số alen được phát hiện), trong khi tỷ lệ alen duy nhất lại cao hơn nhiều (51 trong số 309 alen, chiếm ≈ 16,5% tổng số alen được phát hiện), cho thấy mức độ tương đồng di truyền thấp giữa các mẫu tôm sú nghiên cứu.

Khi so sánh chi tiết vị trí các alen của các mẫu tôm sú giữa các quần đàn với nhau cho thấy: không những các alen ở các mẫu là không trùng nhau hoàn toàn khi so sánh hai mẫu bất kỳ thuộc cùng một quần đàn hay thuộc hai quần đàn khác nhau, mà ở mỗi quần đàn đều có những alen đặc trưng cho quần đàn đó, tức là chỉ xuất hiện ở một hoặc một vài cá thể của một quần đàn mà không thấy có ở các quần đàn khác. Trong đó: Quần đàn BTB có số lượng alen đặc trưng quần đàn nhiều hơn hẳn so với quần đàn NTB và NB.

Khi so sánh số lượng alen duy nhất giữa các quần đàn và tỷ lệ alen duy nhất trên tổng số alen của mỗi quần đàn cho thấy: tỷ lệ này ở quần đàn BTB và NTB đều là 25%, ở quần đàn NB thấp hơn (≈ 20,78%).

Trong phạm vi từng quần đàn, khi so sánh đa hình AFLP giữa các cá thể thuộc cùng một quần đàn cho thấy: trong khi ở quần đàn NTB có 4 alen trùng nhau, ở

quần đàn NB có 8 alen trùng nhau thì điểm đặc biệt của quần đàn Bắc Trung Bộ là trong số 20 mẫu được kiểm tra, mẫu cao nhất thu được 76 alen và mẫu thấp nhất thu được 32 alen nhưng không có bất kì alen nào trùng nhau. Điều này cho thấy tính đa dạng di truyền rất cao của các cá thể trong quần đàn này.

So sánh thành phần alen giữa ba quần đàn cho thấy: giữa 3 quần đàn này không có alen nào trùng nhau (tức là xuất hiện ở tất cả 60 mẫu của cả 3 quần đàn).

Từ những nhận định trên đây có thể kết luận: 60 mẫu tôm sú nghiên cứu thuộc 3 quần đàn khác nhau thể hiện sự đa hình di truyền rõ rệt. Mỗi cá thể đều là khác biệt hay nói cách khác chúng có kiểu gen khác nhau. Sự đa hình này không chỉ thể hiện giữa các cá thể bên trong mỗi quần đàn mà còn là đa hình giữa các quần đàn tôm sú thuộc các khu vực phân bố khác nhau về mặt địa lý.

Từ kết quả phân tích và so sánh về số lượng alen đặc trưng quần đàn, số lượng alen duy nhất, tỷ lệ alen duy nhất trên tổng số alen của mỗi quần đàn và số lượng alen trùng nhau bên trong mỗi quần đàn cũng như giữa các quần đàn, có thể cho phép đưa ra nhận định bước đầu: trong số 3 quần đàn tôm sú tự nhiên nghiên cứu, quần đàn BTB thể hiện sự đa hình di truyền (đa hình AFLP) cao nhất và thấp nhất là quần đàn NB.

Các nhận định này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo et al. (2004) khi nghiên cứu tính đa hình của ba quần đàn tôm sú (gồm 2 quần đàn tôm sú Việt Nam và 1 quần đàn tôm sú nhập ngoại từ Singapore) bằng phương pháp phân tích microsatellite. Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả này cho thấy: ngay trong nội bộ một quần đàn và giữa các quần đàn tôm cũng thể hiện tính đa hình di truyền cao; Ba quần đàn với tổng số 83 cá thể là 83 sự khác biệt với 83 kiểu gen khác nhau, có rất ít hoặc không có alen trùng nhau; Khi phân tích cây phát sinh chủng loại thì 2 quần đàn tôm Việt Nam thuộc cùng một nhánh tách biệt hoàn toàn với nhánh tôm nhập từ Singapore còn lại; Quần đàn tôm sú ở vùng Phú Yên (thuộc vùng Trung Bộ) thể hiện tính đa hình cao hơn so với quần đàn vùng Rạch Gốc (Nam Bộ).

Nguyên tắc thu mẫu được mô tả ở phần trên được xem là một trong những yếu tố quan trọng đảm bảo cho tính chính xác của kết quả phân tích.

Tuy nhiên đây mới chỉ là nhận định bước đầu trong phạm vi kết quả nghiên cứu của đề tài này. Để có thể khẳng định được mức độ đa hình di truyền của các quần đàn tôm sú tự nhiên Việt Nam thì cần phải tiến hành thêm nhiều nghiên cứu trên nhiều quần đàn với số lượng mẫu lớn hơn, đặc biệt cần có các số liệu nghiên cứu về các chỉ số đa dạng di truyền của các quần đàn đó.

Một số kết quả nghiên cứu của các nhóm tác giả khác trên các đối tượng tôm sú thuộc các quần đàn địa lý khác nhau trong khu vực cũng cho thấy những nhận định tương tự về tính đa dạng di truyền của các quần đàn tôm tự nhiên.

Khamnamtong et al. (2009) đã nghiên cứu đa hình di truyền và sự khác biệt địa lý ở tôm sú thu ở 3 vùng khác nhau ở Thái Lan. Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự đa hình di truyền cao trên các đối tượng tôm khảo sát, không có sự tương đồng di truyền mà có sự khác biệt rất lớn trong thông tin di truyền của các cá thể. Sự đa dạng di truyền trên tôm cũng được thể hiện trong các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật microsatellite (Supungul et al., 2000).

Klinbunga et al. (2001) nghiên cứu tính dị hợp về thông tin di truyền trên tôm sú Thái Lan bằng kỹ thuật RAPD và phân tích DNA ty thể bằng kỹ thuật RFLP. Kết quả nghiên cứu của nhóm này cho thấy sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các cá thể thu ở 5 vùng địa lý khác nhau. Các cá thể thuộc cùng một khu vực địa lý cũng ít cho thấy sự tương đồng, mỗi cá thể mang một kiểu gen riêng.

Khedkar et al. (2013) nghiên cứu sự biến đổi trình tự D-loop ty thể với vai trò là chỉ thị đối với đa dạng di truyền các quẩn thể tôm sú ở một vùng biển của Ấn Độ.

Kết quả cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao nhất được quan sát thấy trong quần thể Kakinada, trong khi mức độ đa dạng thấp nhất được quan sát thấy ở quần thể Nellore. Kết quả cũng chỉ ra rằng: nhìn chung các quần thể dọc theo bờ biển Andhra Pradesh rất đa dạng về mặt di truyền mặc dù thực tế có dòng gen trao đổi đáng kể giữa chúng.

4.5. LỰA CHỌN KỸ THUẬT CHỈ THỊ AFLP ĐỂ ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH HỆ GEN TÔM SÚ

Có nhiều phương pháp khác nhau để đánh gia đa hình di truyền quần thể, bao gồm: nhóm các phương pháp DNA finger priting (RAPD, RFLP, AFLP), nhóm các phương pháp giải trình tự gen và nhóm các phương pháp lai phân tử (lai bằng array). Mỗi phương pháp có những ưu điểm và hạn chế nhất định, phù hợp với các mục đích nghiên cứu khác nhau. Nhiều nghiên cứu về đa hình hệ gen sử dụng các kỹ thuật chỉ thị phân tử, phổ biến nhất là microsatellite hoặc kết hợp microsatellite với các chỉ thị phân tử khác (Alam, 2016; Maralit et al., 2015). Bản đồ liên kết của tôm sú Penaeus monodon chứa 256 chỉ thị microsatellite và 85 chỉ thị AFLP đã được công bố (You et al., 2010). Microsatellite thường được sử dụng để lập các bản đồ liên kết ở tôm sú Penaeus monodon vì chúng có số lượng lớn và hàm lượng thông tin đa hình cao, trong khi AFLP lại được ưa chuộng vì kỹ thuật này dễ thực hiện mà không cần biết trước thông tin về hệ gen (Mueller et al., 1999; You et al., 2010). Trong nghiên cứu của Tassanakajon et al. (1998), 58 marker RAPD đa hình kích thước từ 200 - 2200 bp đã được sử dụng để phân biệt về mặt di truyền giữa hai quần thể tôm sú P. monodon thuộc hai vùng nuôi trồng thủy sản khác nhau tại Thái Lan. Để nghiên cứu đa hình di truyền và cấu trúc quần thể ở tôm sú P. monodon, các chỉ thị allozyme cũng đã được sử dụng (Sugama et al., 2002). Tuy nhiên, cũng giống như RFLP và RAPD, chỉ thị allozyme có những hạn chế rõ rệt về mặt kỹ thuật so với AFLP. Trong khi đó, AFLP đã khắc phục được những hạn chế và đồng thời kết hợp được những điểm mạnh của cả hai kỹ thuật AFLP và RAPD. AFLP đã được phát triển để phân tích đồng thời nhiều locus. Kỹ thuật này đã được ứng dụng để tạo ra 23 điểm nhận dạng nhằm phân biệt giữa các giống cá hồi tự nhiên và lai tạo (Maralit et al., 2015)…

Với những ưu thế rõ rệt, kỹ thuật AFLP đã được lựa chọn sử dụng trong nghiên cứu này để đánh giá đa hình hệ gen tôm sú vì phương pháp này phù hợp với mục tiêu và tình hình nghiên cứu thực tế. AFLP kết hợp được cả những thế mạnh của RAPD và RFLP, đồng thời khắc phục được những hạn chế của chúng. Việc sử dụng

kỹ thuật AFLP cho phép sàng lọc đồng thời nhiều vùng DNA khác nhau phân bố ngẫu nhiên trên toàn hệ gen mà không cần biết trước thông tin về trình tự genome.

Phương pháp này cho kết quả có độ tin cậy cao vì tính nghiêm ngặt của PCR, thực hiện qua hai bước sàng lọc. AFLP cho phép ghi nhận một lượng lớn đa hình trên trên một bản gel polyacrylamide duy nhất mà không cần bất kỳ nghiên cứu hay phát triển nào trước đó. Do đó phương pháp này thực hiện nhanh chóng, ít tốn kém.

Trong phạm vi nghiên cứu này, kỹ thuật AFLP là phương pháp phù hợp để đánh giá và so sánh đa hình hệ gen tôm sú thuộc các quần đàn địa lý khác nhau vì với tính nghiêm ngặt cao của PCR sử dụng các nucleotide chọn lọc để thực hiện hai bước PCR sẽ đảm bảo hạn chế đáng kể những sai khác di truyền mang tính ngẫu nhiên. Ngoài ra, với việc sử dụng các hóa chất (kit) và thiết bị thí nghiệm chuẩn giúp hạn chế tối đa sai số thí nghiệm. Kết quả về đa hình thu được khẳng định đây là “đa hình AFLP” - đa hình về vị trí và số lượng alen xuất hiện giữa các mẫu đại diện cho các quần đàn trong cùng điều kiện phân tích.

4.6. QUAN HỆ PHÁT SINH CHỦNG LOẠI GIỮA CÁC QUẦN ĐÀN TÔM SÚ

Cây phát sinh chủng loại của các mẫu tôm sú nghiên cứu thuộc 3 quần đàn tự nhiên vùng biển Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Nam Bộ của Việt Nam phản ánh rõ mối tương quan về mặt di truyền giữa chúng. Nhìn chung, các cá thể thuộc cùng một quần đàn có mức độ tương đồng về mặt di truyền (thể hiện ở các nhánh gần nhau trên cây phân loại) cao hơn so với các cá thể thuộc các quần đàn khác nhau.

Hiện tượng một số cá thể thuộc quần đàn này lại xuất hiện trên nhánh phân loại của quần đàn khác có thể được giải thích bởi các nguyên nhân sau: (1) Do sự di cư của các đàn tôm sú trong tự nhiên từ vùng biển này đến vùng biển khác theo các dòng hải lưu để tìm kiếm nguồn thức ăn và môi trường mới thích hợp với giai đoạn sinh trưởng của chúng; (2) Do người nuôi tôm đánh bắt tôm sú bố mẹ từ tự nhiên đem về để sản xuất tôm giống, bán cho người nuôi ở các khu vực khác (Bắc, Trung, Nam), khi nuôi có thể tôm thoát ra ngoài tự nhiên nên có sự pha tạp.

Các kết quả này phù hợp với đặc điểm nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam cũng như ở các khu vực khác trên thế giới. Tính chất đa hình về mặt di truyền giữa các cá thể trong cùng một quần đàn và giữa các quần đàn, cũng như sự pha tạp cá thể giữa các quần đàn tiếp giáp cũng phù hợp với nhận định của các tác giả khác khi nghiên cứu về đa hình di truyền ở các quần thể tôm tự nhiên. Mặc dù vị trí địa lý của các quần đàn thu mẫu là khác nhau giữa các nghiên cứu nhưng về cơ bản đều cho thấy các quần thể tôm sú ở các vùng phân bố khác nhau có sự khác biệt rõ rệt về mặt di truyền giữa các quần thể địa lý (Pan et al., 2004). Theo đó, tôm giống tự nhiên ở những vùng khác nhau cũng sẽ khác nhau về sức sinh sản, tỷ lệ sinh trưởng, khả năng chống chịu bệnh và nhiều đặc tính khác (Kim Thị Phương Oanh et al., 2010).

Nhìn chung, sự đa hình hiện diện trong các quần thể tự nhiên có sự khác nhau rõ rệt ở các loài khác nhau Charlesworth et al. (2017).

Mặt khác, tùy thuộc vào phương pháp đánh giá đa hình được sử dụng mà kết quả phân tích và mô hình cây phát sinh chủng loại được thể hiện giữa các nghiên cứu cũng khác nhau, thậm chí trên cùng một đối tượng nghiên cứu hoặc trên các mẫu nghiên cứu được thu thập từ các quần thể khá tương đồng về mặt địa lý. Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo et al. (2004), phương pháp phân tích microsatellite được sử dụng để đánh giá đa hình ở ba quần đàn tôm sú tự nhiên cũng đã cho thấy có rất ít hoặc không có alen trùng nhau. Tuy nhiên mô hình cây phát sinh chủng loại biểu thị 2 quần đàn tôm sú Việt Nam (thu thập tại các vùng biển Phú Yên (thuộc vùng Trung Bộ) và vùng Rạch Gốc (Nam Bộ) thuộc cùng một nhánh tách biệt hoàn toàn với nhánh tôm nhập từ Singapore còn lại.

Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA đã đưa ra một mô hình cây tương đối khái quát về mối quan hệ về mặt di truyền giữa các mẫu tôm sú nghiên cứu. Phần mềm MEGA tính toán khoảng cách tiến hóa dựa trên sự khác biệt quan sát được trong các chuỗi amino acid và nucleotide. Các so sánh được thực hiện theo từng cặp (Nei & Kumar, 2000; Swofford et al., 1996). Phương pháp bootstrap được phần mềm MEGA sử dụng để ước tính phương sai của tất cả các đại lượng thống kê được tính toán và để kiểm tra các giả thuyết. Thông tin so sánh được