Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.5 Phương pháp thu thập, phân tích và đánh giá các chỉ tiêu thí nghiệm
Chỉ tiêu phân tích đa dạng di truyền SSR gồm ly trích DNA và sử dụng phương pháp PCR chỉ được thực hiện ở Thí nghiệm 1 khi so sánh đặc tính di truyền của 10 dòng/giống khoai lang tím sưu tầm được. Các chỉ tiêu đánh giá về đặc tính sinh trưởng, năng suất và phẩm chất thịt củ khoai lang được trình bày ở Bảng 3.3, trong đó tùy theo mục tiêu của thí nghiệm sẽ được chọn lọc đánh giá các chỉ tiêu chính.
Ghi nhận chỉ tiêu sinh trưởng tại các thời điểm: 30, 60, 90, 120 ngày SKT và tại thời điểm thu hoạch, riêng thí nghiệm 1 được đánh giá ở thời điểm 20, 60 và 100 ngày SKT. Thu thập chỉ tiêu tại 3 vị trí cố định trên 1 lô thí
nghiệm (từ đầu luống lấy vào 0,5 m; 1,5 m; 2,5 m), tại mỗi vị trí lấy ngẫu nhiên 3 dây (tổng cộng là 9 dây khoai lang cho một lần lặp lại).
Tại thời điểm thu hoạch, tiến hành thu thập tất cả các chỉ tiêu năng suất và thành phần năng suất. Thu hoạch tất cả diện tích thí nghiệm để ghi nhận năng suất thực tế và quy về năng suất tấn/ha.
Bảng 3.3: Bảng ghi nhận các chỉ tiêu thí nghiệm A. Chỉ tiêu sinh trưởng của thân, lá
1. Chiều dài dây dài nhất 5. Số nhánh 2. Đường kính thân dây
3. Chiều dài lóng thân
6. Diện tích lá, số lượng khí khẩu 7. Chỉ số diệp lục tố (SPAD)
4. Chiều dài cuống lá 6. Hàm lượng chlorophyll và carotenoids B. Các chỉ tiêu năng suất tại thời điểm thu hoạch
1. Khối lượng thân lá/m2 4. Năng suất củ thương phẩm 2. Hàm lượng chất khô thân lá 5. Năng suất tổng
3. Số lượng củ thương phẩm và trọng lượng trung bình củ thương phẩm
C. Các chỉ tiêu phẩm chất thịt củ
1. Hàm lượng anthocyanins 5. Độ ẩm thịt củ, hàm lượng chất khô 2. Hàm lượng flavonoids 6. Độ cứng củ
3. Hàm lượng đường tổng số 7. Độ brix thịt củ
4. Hàm lượng tinh bột 8. Phân tích hàm lượng NPK trong thân lá và thịt củ một số thí nghiệm
- Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền 10 dòng/giống khoai lang tím:
+ Ly trích DNA: thu thập mẫu lá khoai lang của 10 dòng/giống khoai lang tím trong thí nghiệm. DNA được ly trích theo phương pháp của Doyle and Doyle (1990) và Borges et al. (2009) có cải tiến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Nghiền 100 mg mô lá khoai lang bằng ni tơ lỏng bằng cối và chày. Chuyển mẫu đó nghiền mịn sang ống eppendorf 1,5 ml. Thờm 700 àl dung dịch S-buffer (11 ml 1M Tris; 11 ml 0,5M EDTA; 8,765 g NaCl; 11 ml 10% CTAB, thờm 1% β-mercaptopethanol trước khi sử dụng). Bổ sung 140 àl 10% SDS, trộn đều. Ủ ở 65oC trong 30 phút, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 5 phỳt. Thờm 700 àl Chloroform:Isoamylalcohol (24:1), trộn đều. Ly tõm 11.000 rpm trong 15 phút. Thu dịch nổi. Kết tủa bằng Isopropanol lạnh (2/3 thể tích). Ly tâm 11.000 rpm trong 15 phút. Thu kết tủa, rửa với 70% ethanol (2 lần). Làm khụ. Hũa tan với 50àl dung dịch TE. Trữ -20oC. Sau đú, DNA được kiểm tra chất lượng trên gel agarose nồng độ 0,5%
+ Phương pháp PCR: sử dụng 31 SSR markers trên khoai lang (Phụ Bảng 2.1), đây là các marker có chỉ số đa hình (PIC) từ 0,14 – 0,96 theo các
nghiên cứu trước. Sau khi tiến hành chạy PCR (Phụ Bảng 2.2, Phụ Bảng 2.3), tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với gel agarose nồng độ 2,5%, điện thế 150V trong 1h30 phút. Kết quả đánh giá SSR marker được mã hoá dưới dạng bảng số liệu nhị phân (1: có band; 0: không có band).
+ Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình: sử dụng phần mềm NTSYS-pc version 2.1 phân tích dữ liệu. Đây là chương trình do Rohlf (2000) đề xuất để phân loại số trong nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ DNA, các mẫu có hệ số tương đồng sẽ được phân cùng một nhóm và thông qua sơ đồ hình cây (cây tiến hóa) để phản ảnh mức độ đa dạng và mối quan hệ di truyền của các cá thể nghiên cứu.
- Mô tả các chỉ tiêu sinh trưởng:
+ Chiều dài dây dài nhất (cm): đo bằng thước dây, chọn dây chính đo chiều dài dây dài nhất từ mặt đất đến ngọn của nhánh dài nhất trên dây (giữ cho thước song song với dây), ghi nhận kết quả.
+ Đường kính thân dây (cm): chọn dây chính, dùng thước kẹp đo vị trí trên thân cách mặt đất 10 cm, ghi nhận kết quả.
+ Chiều dài lóng thân (cm): tại các dây được chọn, dùng thước đo 3 lóng liền nhau, tính từ lá trưởng thành thứ 3 kể từ đọt. Đọc và ghi nhận kết quả.
+ Chiều dài cuống lá (cm): đo 3 cuống lá liền kề kể từ lá trưởng thành thứ 3 từ đọt.
+ Số nhánh (đếm): đếm số nhánh mọc ra từ thân chính, nhánh được tính có chiều dài hơn 10 cm.
+ Diện tích lá (cm2): chọn 2 lá trưởng thành đại diện cho 1 lần lặp lại (bỏ 3 lá non trên đọt của dây, ngắt lá thứ 4), đem về phòng thí nghiệm đo diện tích trên máy đo diện tích lá Leaf area metter (Nhật).
+ Số lượng khí khẩu (số khẩu/cm2): (chỉ thực hiện ở thí nghiệm 1) đếm số lượng khí khẩu ở mặt trên và mặt dưới lá ở thị trường kính hiển vi X40 có đường kớnh thị kớnh là 440 àm và tớnh toỏn quy về số lượng khớ khẩu trờn 1 cm2.
+ Chỉ số diệp lục tố (chỉ số Spad): 1 lần lặp lại sẽ đo 2 lá trưởng thành (bỏ 3 lá non trên đọt của dây, đo lá thứ 4), đo chỉ số diệp lục tố bằng máy SPAD Chlorophyll meter 502 plus (Konica Minolta). Tiến hành đo ba loại lá, gồm: lá non (lá ngọn vừa xòe ra), lá trưởng thành (đo lá thứ 4 tính từ đọt ngọn) và lá già (đo lá thứ 10 tính từ đọt ngọn).
+ Hàm lượng diệp lục tố của lỏ trưởng thành (àg/g lỏ tươi): hàm lượng diệp lục tố và carotenoids theo phương pháp của Wellburn (1994) bổ sung theo Yang et al. (1998). Đo bằng phương pháp trắc quang với dịch chiết là dung môi aceton. Mẫu lá trưởng thành sau khi thu về được rửa sạch, xắt nhuyễn và trộn đều, sau đó cân 2 g mẫu cho vào ống nghiệm + 10 ml aceton 80%; khuấy đều bằng đũa thủy tinh trong 20 giây. Lắc đều trong vòng 1 phút, tiếp tục để yên lắng với tổng thời gian là 15 phút tính từ lúc cho 10 ml aceton vào ống nghiệm. Rút 0,5 ml mẫu dịch trích và thêm 4,5 ml aceton 80% vào ống nghiệm, tiến hành đo độ hấp thu quang phổ kế ở 3 bước sóng: 663,2 nm; 646,8 nm. Hàm lượng diệp lục tố a,b và carotenoid tổng số được tính theo các công thức:
Ghi chú:
+ Ca : Hàm lượng diệp lục tố a trong lỏ (àg/g lỏ tươi) + Cb : Hàm lượng diệp lục tố b trong lỏ (àg/g lỏ tươi)
+ Xa và Xb là hàm lượng diệp lục tố a và b có trong 1 ml dịch trích
+ Ca+b : Hàm lượng carotenoids (carotenoid và diệp lục tố) trong lỏ (àg/g lỏ tươi)
+ A470, A646,8, A663,2 là giá trị đo được bằng máy đo quang phổ spectrophotometer tương ứng với các bước sóng 663,2; 646,8 và 470 nm.
Cb = (20,13 x A646,8 – 5,03 x A663,2) x 10 x 5 2
àg/g
Xa = (12,21 x A663,2 – 2,81 x A646,8) Xb = (20,13 x A646,8 – 5,03 x A663,2)
10 x 5
àg/gFW (1.000 x A470)– (3,27 x Xa) – (104 x Xb)
198 2
Ca+b = x
10 x 5 2
àg/g Ca = (12,21 x A663,2 – 2,81 x A646,8) x
10 x 5 2
àg/g Ca = (12,21 x A663,2 – 2,81 x A646,8) x
- Mô tả các chỉ tiêu năng suất và thành phần năng suất:
+ Khối lượng thân lá/m2 (kg/m2): cân tất cả các dây trên diện tích thí nghiệm và tính trung bình về 1 m2.
+ Khối lượng chất khô thân và lá (%): thu ngẫu nhiên 100 g mẫu thân lá tươi của từng đơn vị thí nghiệm, tiến hành sấy ở nhiệt độ sấy 105oC trong 3 ngày liên tiếp và cân đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân kế tiếp nhau không thay đổi thì ngưng.
+ Số củ không thương phẩm (đếm): đếm tổng số lượng củ < 50 g, củ bị sâu bệnh trên luống khoai và tính trung bình trên 1 m2.
+ Số củ thương phẩm (đếm): đếm tổng số lượng củ ≥ 50 g; vỏ bóng, củ suông, không dấu vết sâu bệnh, đường kính > 2 cm trên luống khoai và tính trung bình trên 1 m2.
+ Năng suất củ thương phẩm (tấn/ha): cân trọng lượng củ thương phẩm trên toàn diện tích thí nghiệm và tính trung bình trên 1 m2, quy về năng suất tấn/ha.
+ Năng suất tổng (tấn/ha): thu toàn bộ củ, cân trọng lượng toàn bộ củ trên toàn diện tích thí nghiệm và tính trung bình trên 1 m2. Quy năng suất về đơn vị tấn/ha.
- Mô tả các chỉ tiêu đánh giá phẩm chất thịt củ:
+ Phân tích, so sánh hàm lượng NPK trong thân lá và thịt củ (%):
xác định hàm lượng đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl, công phá mẫu bằng H2SO4 có hỗn hợp Se xúc tác (TCVN 6498:1999). Hàm lượng lân tổng số được xác định theo phương pháp so màu trên máy quang phổ (spectrophotometer), công phá mẫu bằng hỗn hợp chất xúc tác Se và H2SO4
đậm đặc, xác định lân trong dung dịch bằng “màu xanh molypden”, sử dụng antimoan tartrat theo TCVN 8661:2011. Xác định hàm lượng kali bằng cách phá mẫu bằng hỗn hợp chất xúc tác Se và H2SO4 đậm đặc, xác định K trong dung dịch trên máy quang phổ hấp thu nguyên tử (Model Shimazu AA-7000) theo TCVN 8660:2011.
+ Phân tích, so sánh hàm lượng anthocyanins thịt củ (%): xác định hàm lượng anthocyanins theo phương pháp pH vi sai quy về khối lượng chất tươi (KLCT) sau đó quy về phần trăm (Huỳnh Thị Kim Cúc và ctv. (2004) có bổ sung thêm thời gian lắc trong quá trình ly trích theo Steed and Truong (2008). Phương pháp pH vi sai: dựa trên nguyên tắc chất màu anthocyanins
thay đổi theo pH. Tại pH = 1 các anthocyanins tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu. Đo mật độ quang của mẫu tại pH=1 và pH=4,5 tại bước sóng hấp thụ cực đại 530 nm, so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm.Chuẩn bị mẫu:
cân 3 g mẫu tươi + 30 ml dung môi ngâm mẫu 20 giờ (trong đó có 5 giờ lắc 100 vòng/phút) lọc lấy dịch trích đo thể tích Pha loãng dịch trích với dung dịch đệm có pH = 1 và dung dịch đệm có pH = 4,5 đo mật độ quang ở hai bước sóng 530 nm và 700 nm.Xác định lượng anthocyanins (%) theo công thức:
A = (A530nm.pH=1 – A700nm.pH=1) - (A530nm.pH= 4,5 – A700nm.pH= 4,5)
Với A530nm, A700nm là độ hấp thụ tại bước sóng 530 nm và 700 nm ở pH = 1 và 4,5.
M: khối lượng phân tử của anthocyanins cyanidin 3 glucoside, M= 449,2 g/ mol
K: hệ số pha loãng V: thể tích dịch chiết (l)
: hệ số hấp thụ phân tử (=26.900 l/ mol-1.cm-1) l: Chiều dày cuvet (l = 1 cm)
m: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) w: độ ẩm nguyên liệu (%).
+ Phân tích hàm lượng flavonoids trong thịt củ (mg quercetin/100 g KLCT) (mgQE/100 g KLCT)
Hàm lượng flavonoids tổng được xác định theo phương pháp của Mohammed and Manan (2015), dựa trên phản ứng tạo phức màu vàng của ion Al3+ với các flavonoids theo phương pháp đường chuẩn với chất chuẩn là quercetin. Độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 510 nm.Cách xác định đường chuẩn quercetin:Rỳt 600 àl dung dịch quercetin cú nồng độ từ 0 - 500 àg/ml cho vào dóy ống nghiệm cú chứa sẵn 450 àl dung dịch NaNO2 5%, 450 àl dung dịch AlCl3 10% và 2.400 àl NaOH 10%. Hỗn hợp được khuấy đều và
Hàm lượng anthocyanin (%) = A x M x K x V x 100
x l x m x (100 – w) x 10-2
đo ở bước sóng 510 nm. Xác định hàm lượng quercetin có trong mẫu phân tích bằng cách cân một lượng mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10 ml methanol 80%, ngâm mẫu trong vòng 10 phút ở nhiệt độ 80-90oC. Mẫu phân tích được chuẩn bị giống như các bước lập đường chuẩn quercetin. Mẫu blank được thay dung dịch mẫu phân tích bằng dung môi tương ứng. Xác định phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ quercetin với độ hấp thụ quang y = ax + b (với x là độ hấp thụ quang tương ứng, y là nồng độ quercetin). Tính hàm lượng flavonoids trong thịt củ dựa vào phương trình đường chuẩn tính tương đương với hàm lượng quercetin (mg QE/100 g KLCT).
+ Phân tích hàm lượng đường tổng số (theo Dubois et al. (1956)) (mg/g KLCT)
Cân 2 g mẫu thịt củ đã xắt nhuyễn cho vào ống nghiệm, rót vào ống nghiệm có chứa mẫu 10 ml methanol, đậy nắp kín, đun cách thủy ở nhiệt độ 70-80oC trong 10 phút, rót dung dịch đường ly trích được vào ống nghiệm trống, giữ lại phần bã. Trích đường hai lần nữa bằng cách thêm 5 ml methanol vào phần mẫu không tan còn lại, tiếp tục đun cách thủy mỗi lần 5 phút. Trong ống nghiệm còn bã và một ít methanol là tinh bột, vách tế bào... Tiến hành sấy bã ở nhiệt độ 50oC cho đến khi trọng lượng không đổi để phân tích tinh bột.
Gộp dung dịch đường trích được sau ba lần đun và ghi nhận thể tích dịch trích.
Dung dịch đường được pha loãng với nước cất 50 lần để thực hiện phản ứng màu với phenol 5% và H2SO4 đậm đặc. Tỉ lệ đường, phenol và H2SO4
đậm đặc là 1:1:5. Lắc đều mẫu, sau đó xác định độ hấp thụ bằng máy quang phổ quang phổ Spectrophtometer ở bước sóng 490 nm. Hàm lượng đường trong mẫu được tính dựa vào phương trình đường chuẩn glucose (y = ax + b, với x là độ hấp thụ quang tương ứng, y là nồng độ đường), có nồng độ từ 0 - 140 àg/ml.Cụng thức tớnh:
a: àg đường glucose/ml dung dịch của mẫu đo được b: àg đường glucose/ml dung dịch của mẫu Blank H: Hệ số pha loãng
(a-b) x H x V1 V2 x m x 103 Đường tổng số (mg/g KLCT) =
m: khối lượng mẫu tươi ban đầu (g)
V1: thể tích dịch đường còn lại sau khi đun cách thủy (ml) V2: thể tích dịch đường đo mẫu (ml)
103: đổi àg ra mg đường glucose.
+ Tính hàm lượng tinh bột (theo Coombs et al., 1986) (mg/g KLCT) Sấy khô lượng xác bã còn lại của mẫu củ sau khi ly trích đường ở nhiệt độ 50oC cho đến khi trọng lượng không đổi. Xác định khối lượng mẫu sau khi sấy, cân 1 g mẫu cho vào ống nghiệm có sẵn 5 ml nước cất, thêm 6,5 ml HClO4 (54%), lắc mẫu trong vòng 15 phút. Lọc lấy dịch trích, phần cặn bã tiếp tục cho 2,5 ml nước cất + 0,25 ml HClO4 54%, khuấy lắc mẫu trong 15 phút. Sau đó tập trung phần dịch lọc còn lại và đem định mức ở bình 50 ml.
Sau đó pha loãng dịch trích 100 lần bằng nước cất. Rút 1 ml dịch trích đã pha loãng + 0,5 ml phenol 5% + 2,5 ml H2SO4 đậm đặc, lắc đều, đặt trong chậu nước và để yên trong 10 phút. Xác định độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 490 nm.
Xác định hàm lượng tinh bột có trong mẫu bằng đường chuẩn glucose có nồng độ từ 0 - 150 àg/ml. Phương trỡnh đường chuẩn glucose (y = ax + b, với x là độ hấp thụ quang tương ứng, y là nồng độ đường). Rút 1 ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml HClO4 0,2028%, sau đó thêm 0,5 ml phenol và 2,5 ml H2SO4 đậm đặc, lắc đều, đặt trong chậu nước và để yên trong 10 phút. Xác định độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 490 nm.
Công thức tính:
Trong đó:
a: àg/ml đường của mẫu đo được
H: hệ số pha loãng = 50 x 100 = 5.000 lần m: khối lượng mẫu tươi ban đầu (g)
m1: khối lượng mẫu được sấy khô sau khi ly trích đường tổng số (g) m2: khối lượng mẫu được sử dụng phân tích tinh bột (g)
1.000: quy đổi àg ra mg V: thể tích mẫu rút (ml)
a x H x m1
V x m2 x m x 1.000 Hàm lượng tinh bột (mg/g KLCT) =
+ Hàm lượng chất khô thịt củ (%):
Cân 10 g nguyên liệu thịt củ sau khi đã được cắt nhuyễn, trộn đều và cho vào đĩa petri (đã sấy đến khối lượng không đổi). Đem đĩa petri chứa mẫu sấy ở nhiệt độ 105oC đến khi khối lượng không đổi, cân xác định khối lượng.
Độ ẩm được tính theo công thức:
Trong đó:
X: khối lượng chất khô trong mẫu tươi (%) G1: khối lượng đĩa petri và mẫu trước khi sấy (g)
G2: khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g) m: khối lượng mẫu tươi (g)
Hàm lượng chất khô (%) = 1- X (độ ẩm)
+ Độ cứng củ (kgf/mm2): được xác định bằng thiết bị đo độ cứng nhãn hiệu TA XT 2i UK bằng lực xuyên thấu với loại đầu đo tròn P2 có đường kính 2 mm. Đặt máy ở một vị trí cố định. Trên từng củ, tiến hành ấn lần lượt củ vào đầu mũi kim ở ba vị trí là hai vị trí ở đầu củ và một vị trí ở giữa củ (mỗi vị trí lặp lại 2 lần) đến khi vừa xuyên qua vỏ củ. Lấy chỉ số trung bình của 6 kết quả về giá trị đo.
+ Độ Brix thịt củ (trị số): cân 1 g mẫu khoai đã cắt nhuyễn cho vào cối, sau đó thêm 2 ml nước cất rồi nghiền đều mẫu, lọc qua giấy lọc lấy dịch trích đem đo trên máy đo độ Brix Milwaukee Refractometer