Kết quả của đề tài tại Bảng 3.1, Bảng 3.2, cho thấy: Có 125 mẫu thuốc nam với 44 vị thuốc; 380 mẫu thuốc bắc với 50 vị thuốc. Tổng số có 505 mẫu thuốc với 94 vị thuốc đã được sử dụng trong nghiên cứu. Đây là các vị thuốc 100% có tên trong danh mục thuốc được bảo hiểm chi trả và lả danh mục thuốc thiết yếu trong hoạt động chuyên môn về y học cổ truyền.
Tỷ lệ phát hiện nhiễm nấm chung bằng kỹ thuật soi tươi trong môi trường KOH20% tại Bảng 3.3 là 34,46%, tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc nam cao hơn thuốc bắc, với các tỷ lệ 62,40% so với 25,26%, với p < 0,01.
Mặt khác, kết quả tại Bảng 3.5, Bảng 3.6 và Hình 3.1 cho thấy tỷ lệ phát hiện nhiễm nấm bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud cao hơn kỹ thuật soi trực tiếp trong môi trường KOH20%, cụ thể tỷ lệ nhiễm nấm chung là 51,80%, trong đó tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc bắc là 45,53%, ở các mẫu thuốc nam là 72,80%.
Kết quả này cho phép nhận định:
- Tỷ lệ nhiễm nấm trong các mẫu thuốc nam tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An nói chung là cao, cao hơn tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc bắc, với các tỷ lệ nhiễm nấm tương ứng (62,40% so với 25,26%, p < 0,01) và (72,80% so với 45,53%, p < 0,01).
- Tỷ lệ phát hiện nhiễm nấm bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud cao hơn kỹ thuật xét nghiệm trực tiếp trong môi trường KOH20% (51,80% so với 34,46%, p < 0,01).
Kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với thực tiễn là hiện nay là phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm bằng nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud vẫn là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, vì có nhiều ưu điểm sau:
- Tỷ lệ phát hiện các mẫu xét nghiệm nhiễm nấm cao;
- Kỹ thuật xét nghiệm nuôi cấy đơn giản, có thể áp dụng cả ở thực địa.
- Môi trường nuôi cấy nấm bán sẵn trên thị trường, có chất lượng rất tốt, dễ bảo quản. Từ môi trường Saboraud cơ bản có thể pha chế thành nhiều loại môi trường khác nhau phục vụ các mục đích khác nhau.
Kết quả tại Bảng 3.6, cho thấy các mẫu thuốc bắc có nguồn gốc là hoa, quả có tỷ lệ nhiễm nấm cao hơn các mẫu thuốc có nguồn gốc từ thân, lá và củ (50,00% so với 45,16% và 44,24%), tuy nhiên sự khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê vơi p > 0,05. Điều này khác với các mẫu thuốc nam, các mẫu thuốc có nguồn gốc từ củ có tỷ lệ nhiễm nấm cao hơn các mẫu thuốc có nguồn gốc từ hoa, quả và thân lá (86,67% so với 67,50% và 69,09%) sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Kết quả nghiên của đề tài này cũng phù hợp với thực tế là:
- Các mẫu thuốc nam hầu hết là khai thác sơ chế bằng phơi khô, sao, sấy không hề có các biện pháp bảo quản gì khác. Khi gặp điều kiện thời tiết nóng, ẩm thì rất dễ bị nhiễm nấm.
- Đối với các mẫu thuốc bắc hầu hết có sử dụng từ 1 đến nhiều hình thức bảo quản vật lý, hóa học... như: Tẩm, sao, sấy, sông khói, một số vị thuốc còn có thể có cả kim loại nặng để bảo quản, vì vậy tỷ lệ nhiễm nấm thấp hơn thuốc nam là hợp lý. Tuy nhiên vấn đề kiểm soát các chất bảo quản
còn nhiều điều cần nghiên cứu sâu hơn, trong giới hạn đề tài không đi sâu nghiên cứu.
Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng phù hợp với một số nghiên cứu trong và ngoài nước như:
- Đặng Bích Thủy (2008), nghiên cứu tại Kiến Xương - Thái Bình cho thấy chỉ có 35,6% số mẫu lạc, 48,9% số mẫu đỗ tương được bảo quản trong các gia đình đúng cách, tỷ lệ nhiễm nấm trong các mẫu lạc 13,3% và 24,4%
mẫu đỗ tương [54].
- Nghiên cứu của Nguyễn Đinh Nga (2012), nghiên cứu khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trong một số dược liệu bán ở Quận 5 – Thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp định danh loài nấm bằng khóa định loài và định lượng aflatoxin bằng Kit ELISA, kết quả cho thấy: Tỷ lệ nhiễm nấm trong dược liệu là 61%(86/141) [33].
- Lý Thu Hương (2012), nghiên cứu tình trạng nhiễm vi nấm và ochratoxin A trong đất và rễ cây trồng tại Tây Nguyên, kết quả cho thấy: Tỷ lệ nhiễm vi nấm là 43,75%, tỷ lệ nhiễm nhiễm vi nấm thay đổi từ 11,1% đến 62,5% [20].
Tại Việt Nam cho đến nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu sâu và bài bản về thành phần loài nấm ký sinh trên thuốc đông dược. Vấn đề sử dụng dược liệu là cây, con làm thuốc là nét văn hóa đặc trưng của các nước Châu Á, trong đó có Việt Nam. Với thuốc đông dược có nhiều cách chế biến và dù chế biến bằng cách nào đi nữa thì người sử dụng vẫn phải ăn, uống...vì vậy, có thể coi “sử dụng thuốc đông dược như sử dụng thực phẩm như của các nước Âu, Mỹ và trên thế giới”. Hiện nay, trên thế giới việc nghiên cứu tình trạng nhiễm nấm phát triển rất mạnh, đa số là các nghiên cứu xác định sự có mặt của nấm thông qua các độc tố của chúng như aflatoxin,
ochatoxin, fumonisin đã trở thành thường quy bắt buộc đối với tất cả các sản phẩm thực phẩm tươi sống và chế biến sẵn, đặc biệt là các sản phẩm nhập khẩu từ các nước nông nghiệp kém phát triển. Các nước công nghiệp tạo ra hàng rào kỹ thuật để bảo vệ sức khỏe người dân của họ tốt hơn. C=Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nhiễm nấm và độc tố của nấm trong thực phẩm, điển hình là nghiên cứu của các nhà khoa học:
- Elisabeth Streit và CS (2012), đã thống kê và phân tích sự hiện diện của nấm thông qua độc tố nấm trong thời gian 8 năm tại Châu Âu và Châu Á ở 17 316 mẫu đồ ăn và nguyên liệu thô với các chỉ số đánh giá tình trạng nhiễm nấm thông qua tỷ lệ nhiễm các độc tố aflatoxin, ochratoxin A, deoxynivalenol và fumonisin. Kết quả: 72,0% mẫu thực phẩm (+) với 1 loại độc tố của nấm; 38,0% nhiễm từ 2 loại độc tố của nấm trở lên; Đặc biệt giai đoạn 2005 đến 20111 tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong thực phẩm đã tăng từ 32,0% năm 2005 lên 71,0% năm 2011 [71].
- Kwale, Isiolo, Tharaka-Nithi, Kisii và Bundoma năm 2014, nghiên cứu ở 5 quốc gia Châu Phi với 4 vùng sinh thái khác nhau xác định tình trạng nhiễm nấm thông qua xác định sự có mặt của aflatoxin B1, kết quả:
76% mẫu ngô, 64% mẫu kê, 60% mẫu lúa nhiễm độc tố của nấm, có nghĩa là tỷ lệ nhiễm nấm còn cao hơn tỷ lệ nhiễm các độ tố phát hiện ở trên [59].
- Manish Adhikari và CS (2017), đã công bố kết quả của công trình nghiên cứu về vai trò của độc tố T-2 mycotoxin với quá trình ung thư hóa và gây quái thai, dị tật ở thai nhi. Độc tố T-2 mycotoxin này do nấm Fusarium spp sinh ra trong quá trình ký sinh ở vật chủ. T-2 mycotoxin gây rối loạn quá trình phát triển của thai nhi, nhất là trong giai đoạn đầu hình thành các cơ quan trong cơ thể thai nhi [86].
Như chúng ta đã biết, hầu hết các vị thuốc nam dược được thu mua trong nước, đó là cây, con khai thác tự nhiên, hoặc canh tác như những cây nông nghiệp khác, chỉ sơ chế qua bằng phơi, sấy...không sử dụng bất cứ hình thức bảo quản bằng hóa chất nào khác và các điều kiện bảo quản sau thu hoạch ở nước ta còn rất nhiều hạn chế, vì vậy nguy cơ nhiễm nấm cao hơn các vị thuốc bắc là phù hợp với thực tiễn. Kết hợp với điều kiện thời tiết nước ta là nhiệt đới, nóng, ẩm, mưa nhiều cũng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển.
Mặt khác, đa số các vị thuốc bắc được trồng, khai thác, chế biến, sao tẩm và sử dụng các phương pháp bảo quản bằng hóa học như hơi lưu huỳnh, giem sa, sử dụng các kim loại nặng bảo quản... vì vậy, tỷ lệ nhiễm nấm thấp hơn các vị thuốc nam dược là phù hợp với thực tiễn.
4.1.1.2. Kết quả định danh loài nấm ở các mẫu thuốc đông dược bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen
Kết quả của đề tài tại Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4 cho thấy:
- Sản phẩm PCR của các mẫu nấm phân lập từ các mẫu thuốc đông dược tại các bệnh viện thuộc tỉnh Nghệ An chỉ có 1 band duy nhất, rõ nét, kích thước 1200bp. Đồ thị chạy PCR là các đường liên tục rõ nét, rất điển hình và phù hợp với trình tự các nucleotid của các mẫu gen mồi chuẩn quốc tế KF617362.1 đã đăng ký bản quyền tại các labo có uy tín trên thế giới. Kết quả này cũng phản ánh:
- Gen mồi, các điều kiện cho phản ứng PCR, quy trình kỹ thuật thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen mà đề tài sử dụng và thực hiện là phù hợp và tối ưu.
Kết quả tại Bảng 3.9 các mẫu xác định loài có độ tương đồng rất cao >
99,00% với ngân hành gen chuẩn Quốc tế, chỉ có 1 mẫu NA-QC29 có độ
tương đồng chỉ đạt 92,00% và tạm gọi là chủng nấm chưa xác định, cần có nghiên cứu sâu hơn để xác định chính xác tên loài nấm.
Kết quả của đề tài tại các Bảng 3.9, Bảng 3.10 cho thấy đã phát hiện 11 loài nấm khác nhau được phân lập từ các mẫu dược liệu tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An. Kết quả này cũng phản ánh sự đa dạng về thành phần loài nấm cũng như vai trò quan trong của Aspergillus như Aspergillus niger, Aspergillus tubingensis, Aspergillus flavus và một số loài nấm khác trong quá trình gây nhiễm nấm ở thuốc đông dược. Đây là các loài nấm có tỷ lệ cao nhất Aspergillus niger chiếm tới 60,0%, Aspergillus tubingensis chiếm 18,0%.
Kết quả của chúng tôi cũng rất tương đồng với một số đề tài nghiên cứu trong và ngoài nước như:
- Lý Thu Hương (2012), nghiên cứu tình trạng nhiễm vi nấm và ochratoxin A trong đất và rễ cây trồng tại Tây Nguyên, kết quả cho thấy:
Thành phần loài nấm nấm chủ yếu là Aspergillus niger và Penicillium viridicatum [20].
- Andre El Khoury và CS (2011), đã sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP của vùng đệm (vùng giao gen aflJ và aflR), sau đó các sản phẩm được sử dụng enzyme phân cắt giới hạn (RFLPs) để nghiên cứu thành phần loài nấm gây nhiễm độc alflatoxin ở nho. Kết quả các sản phẩm sinh ra từ Aspergillus flavus chia thành 3 đoạn 362, 210 và 102 bp, trong khi chỉ có 1 vị trí giới hạn của ở Aspergillus paraciticus sinh ra 2 phân đoạn 363 và 311 bp. Dựa vào kết quả này đã định danh thành phần các loài nấm ở nho chủ yếu do 2 loài Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus chiếm tới > 70% thành phần loài nấm [58].
- Fabiana Aparecida Couto (2014), nghiên cứu sự đa dạng quần thể nấm ở 18 nhóm hạt cà phê theo cách trồng truyền thống tại vùng Nam Minas
Brazil, kết quả ông đã thu được 32 loài nấm thuộc 13 giống nấm khác nhau trong danh mục sau:
+ Aspergillus spp.
+ Penicillium spp + Fusarium spp + Cladosporium spp + Mucor spp
+ Rhizopus spp + Trichoderma spp + Epicoccum spp + Phoma spp + Bipolasis spp + Glomerella spp + Collectotrichum spp
+ Altermaria và Gliocladium spp.
Giống chiếm tỷ lệ cao nhất Aspergillus gồm hai loài Aspergillus plavus, Aspergillus niger. Một số mẫu đa nhiễm là sự kết hợp hai loài Aspergillus plavus với Cladosporium spp..[ 73]
- C. El AARaj và CS (2015), sử dụng kỹ thuật PCR với gen mồi ITS4, ITS5 của ADN ribosomal xác định tỷ lệ thành phần loài nấm Aspergillus spp và Penicillium spp trong 88 mẫu lúa mì, gạo, hạt cà phê, kết quả điện di PCR là những băng rõ nét, ranh giới rõ, chứng tỏ mồi và quy trình chạy PCR là phù hợp và tối ưu. Khi phân tích các chuỗi gen thì Aspergillus spp chiếm
≈ 80%, còn lại là các loài nấm khác 4% [66].
4.1.2. H m lƣợng fl toxin trong m u thuố đông ƣợ tại ệnh viện ủ tỉnh Nghệ An năm 2016
Y học đã chứng minh các độc tố do nấm sinh ra như aflatoxin B1, ochatoxin, fumonisin... là những chất cực độc, chỉ cần 1 lượng nhỏ có thể gây ngộ độc cấp là tử vong, nếu sử dụng 1 lượng rất nhỏ mà kéo dài sẽ tích lũy dẫn đến ung thư gan. Các nhà khoa học đã chứng minh được liều LD50 của aflatoxin như sau: [99].
Độc tính cấp của aflatoxin liều đơn LD50 (mg/kg cân nặng) Tên loài động vật Liều LD50 (mg/kg
cân nặng)
Tên loài động vật Liều LD50 (mg/kg cân nặng)
Thỏ 0,30 Chuột bạch 1,4-2,0
Vịt 11 ngày tuổi 0,43 Vượn Châu Phi 2,0
Mèo 0,55 Gà 6,3
Lợn 0,60 Chuột nhà (đực) 5,5-7,2
Cá hồi 0,80 Chuột nhà (cái) 17,0
Chó 0,5-1,0 Khỉ cái 7,8
Cừu 1,0-2,0 Chuột đồng 9,0
Các nhà khoa học trên thế giới đã khuyến cáo các chính phủ “vấn đề nhiễm độc do nấm mốc trong thực phẩm và chế phẩm nông nghiệp cần được coi là vấn đề sức khỏe cộng đồng cần ưu tiên quan tâm”. Tổ chức Nông - Lương Thế giới ra khuyến cáo việc kiểm tra hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm là yêu cầu bắt buộc để bảo vệ sức khỏe con người, nhất là các sản phẩm thực phẩm nhập khẩu [103], [104].
Kết quả nghiên cứu của đề tài tại Hình 3.1, Bảng 3.11, và Bảng 3.12, trong 505 mẫu thuốc đông dược thì có 262 mẫu nhiễm nấm mốc bằng nuôi
cấy nấm trong môi trường Saboraud. Trong 262 mẫu thuốc đông dược bị nhiễm nấm đã được xét nghiệm định lượng aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao tại Viện Dược liệu Trung ương, kết quả tỷ lệ nhiễm aflatoxin chung trong các vị thuốc đông dược là 4,75% (24/505). Nếu xét riêng các vị thuốc đông dược bị nhiễm nấm thì tỷ lệ nhiễm aflatoxin là 9,10%
(24/262). Trong 24 mẫu nhiễm aflatoxin thì số vượt tiêu chuẩn QCVN 8- 1:2011/BYT (> 0,5bpp) là 66,66% (16/24).
- Kết quả này cũng tương đồng với nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã sử dụng kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao và miễn dịch hoặc định lượng aflatoxin trong thực phẩm, như nghiên cứu của:
+ Phạm Thi Ngọc Lan (2012), khảo sát ô nhiễm thực phẩm trên địa bàn thành phố Huế, kết quả cho thấy: 11,1% mẫu nghiên cứu có ô nhiễm nấm, trong đó 13,6% mẫu kẹo, 19% mẫu tôm cá mực [24].
+ Bùi Thị Mai Hương (2012) [21], đã nghiên cứu ô nhiễm các chất độc do nấm trong lương thực, kết quả:
Trong gạo tỷ lệ nhiễm aflatoxim B1 vượt ngưỡng cho phép là 17,1%, tỷ lệ nhiễm fumonisin B1 vượt ngưỡng cho phép là 6,3%;
Trong ngô tỷ lệ vượt ngưỡng cho phép của aflatoxin B1 là 28,1% và fumonisin B1 là 23,3%.
Bằng cách tính toán lượng tiêu thụ gạo, ngô và sự tích lũy các chất độc aflatoxin B1 và fumonisin B1 tác giả đã đưa ra nguy cơ ung thư gan (nguy cơ ở người sử dụng thực phẩm nhiễm độc tố của nấm) ở hai xã Tả Phời và Hợp Thành: Đối với aflatoxin ở gạo là 7,5/100 000 dân, ngô 5,2/100 000 dân, cả gạo và ngô 12,7/100 000 dân; Đối với fumonisin do gạo là 727,1/100 000 dân, do ngô 37/100 000 dân, cả gạo và ngô 764,9/100 000
dân. Tác giả cũng đã phát hiện sự kết hợp có tích chất tích lũy và cộng hợp giữa nhiều loại thực phẩm và thời gian sử dụng thực phẩm [21].
+ Lý Thu Hương (2012), nghiên cứu tình trạng nhiễm vi nấm và ochratoxin A trong đất và rễ cây trồng, kết quả cho thấy hàm lượng ochratoxin phân tích được ở các mẫu nhiễm Aspergillus niger từ 0,7 – 12 ppb, các mẫu nhiễm Penicillium viridicatum 0,5 đến 8 ppb [20].
+ Kết quả phân tích tại các labo ở Mỹ và Canada của Dr Raj Murugesan (2015), đã phát hiện 381 mẫu lương thực, thực phẩm, thực phẩm chức năng của nhà sản xuất Biomin nhiễm Mycotoxin, trong đó 20 mẫu vượt ngưỡng cho phép. Các Mycotoxin phổ biến nhất là aflatoxin B1, zearalenne, deoxynivalenol, fumonisins, T-2 toxin và ochatoxin A [68].
- Kết quả của đề tài thấp hơn nhiều so với nhiều nghiên cứu:
+ Thông báo của Trung tâm Y tế dự phòng Thành phố Hồ Chí Minh (2010), trên 40 mẫu hạt có dầu và các sản phẩm có liên quan như hạt đậu phộng, vừng, cà phê, dầu ăn, bột dinh dưỡng... có aflatoxin, đặc biệt trong đậu phộng hàm lượng aflatoxin cao gấp 263 lần, kẹo đậu phộng vượt 138 lần tiêu chuẩn quốc gia cho phép [8], [53] .
+ Bùi Thị Mai Hương (2016), đã nghiên cứu tỷ lệ suất ăn nhiễm độc tố aflatoxin B1, ochratoxin A và fumonisins ở người trưởng thành tại Lào Cai Miền Bắc Việt Nam, kết quả cho thấy: Với 1134 mẫu thực phẩm được chuẩn bị tại các gia đình thì tình trạng nhiễm aflatoxin B1 là 39,4 ng/kg/bw/ngày, ochratoxin 18,7ng/kg/bw/ngày. Tỷ lệ này cao hơn nhiều lần giá trị cho phép [8], [77] .
+ Kwale và CS (2014), đã sử dụng kít nhanh xác định tình trạng nhiễm nấm và độc tố do nấm ở 5 quốc gia với 4 vùng sinh thái khác nhau tại
châu phi, kết quả cho thấy: 26% mẫu ngô, 10% mẫu kê, 11% mẫu lúa có hàm lượng aflatoxin B1 vượt ngưỡng cho phép theo tiêu chuẩn Kenya [59].
- Anima J Sirma và CS (2015), nghiên cứu về tình trạng nhiễm aflatoxin trong ngũ cốc trong 408 mẫu thực phẩm từ các hộ gia đình bằng kỹ thuật ELISA, kết quả 77,9% mẫu ngô nhiễm aflatoxin từ 0,17 đến 5,3 ppb, 92,9% các mẫu kê nhiễm aflatoxin từ 0,14 – 6,4 ppb và 50% các mẫu lúa vượt tiêu chuẩn cho phép của quốc gia [57].
Hàm lượng aflatoxin trong các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam và của đề tài này khác nhau có thể giải thích như sau:
- Tỷ lệ, thành phần loài nấm khác nhau ở mỗi vật chủ khác nhau, vì vậy hàm lượng chất độc sinh ra do nấm ở các đối tượng là khác nhau.
- Mỗi tác giả lại sử dụng một phương pháp khác nhau như: Test nhanh, sắc ký khí, sắc ký khí lỏng hiệu năng cao...vì vậy kết quả là khác nhau.
- Các tác giả trên thế giới xác định sự có mặt của nhiều loại chất độc của nấm trong khi chúng tôi chỉ xác định sự có mặt của 1 loại là aflatoxin.
- Tiêu chuẩn an toàn cho phép ở mỗi quốc gia là khác nhau vì vậy tỷ lệ mẫu vượt ngưỡng cho phép cũng rất khác nhau ở các nước.
Cũng tại các Bảng 3.11, và Bảng 3.12 cho thấy chỉ có 24/262 mẫu nhiễm nấm mốc có aflatoxin còn 238 mẫu chưa phát hiện sự có mặt của aflatoxin mặc dù có nhiễm nấm mốc. Điều này có thể giải thích như sau:
- 238 mẫu này mới nhiễm nấm mốc, chưa đủ thời gian tích lũy để nấm mốc ký sinh và sinh độc tố aflatoxin. Nấm chỉ sinh độc tố trong một điều kiện phù hợp nhất định (nhiệt độ 28°, độ ẩm > 70%, ánh sáng yếu...)
- Trong khi ký sinh thì ngoài độc tố aflatoxin được sản sinh nhiều nhất thì còn có một số độc tố khác cũng được tạo ra như: fumonisin, ochatoxin,....