CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng các loại dung môi và nồng độ dung môi đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina
10g tảo bột Spirulina được đổ ra 1 cốc thủy tinh, nghiền trong nito lỏng và bổ sung dung môi (acetone, methanol, ethanol) với nồng độ (60, 70%, 80%, 90%), tỉ lệ cơ chất/dung môi là 1/10 (w/v) và thể tích cuối cùng đạt 100 ml. Cốc thủy tinh được bọc kín, được giữ trong điều kiện tối và thời gian 24 giờ. Sau đó, mẫu được ly tâm 6000 rpm trong 10 phút. Dịch nổi được thu hồi để xác định hàm lượng Chlorophyll a, từ đó chọn được loại dung môi và nồng độ dung môi thích hợp sử dụng cho các bước thí nghiệm sau.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất/dung môi đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina
Cân 10g tảo bột Spirulina vào cốc thủy tinh, nghiền trong nito lỏng, bổ sung dung môi (dung môi và nồng độ chọn được từ thí nghiệm 2.2.2), tỉ lệ cơ chất/dung môi là 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 (w/v). Sau đó mẫu được ủ trích ly ở điều kiện tối, nhiệt độ phòng trong 24 giờ, dung dịch thí nghiệm được ly tâm 6000 vòng trong 10 phút và thu phần dịch nổi để xác định lượng Chlorophyll bằng phương pháp quang phổ, từ đó chọn được tỉ lệ cơ chất/dung môi thích hợp.
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả tách chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina
Cân 10g tảo bột Spirulina vào cốc thủy tinh, nghiền trong nito lỏng, bổ sung dung môi (dung môi và nồng độ chọn được từ thí nghiệm 2.2.2), tỉ lệ cơ chất/dung môi (chọn được từ thí nghiệm 2.2.3). Sau đó mẫu được ủ trích ly trong các khoảng thời gian khảo sát (12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ) ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện tối. Sau đó, dung dịch thí nghiệm được ly tâm 6000 vòng trong 10 phút, thu phần dịch nổi để xác định lượng Chlorophyll, từ đó chọn được thời gian trích ly thích hợp.
2.2.4. Phương pháp xác định nồng độ Chlorophyll
Đối với dung môi acetone, mẫu được đo độ hấp thu ở các bước sóng 664 và 646 nm (Robert J. Porra, 2006). Mẫu trắng (blank) là mẫu chỉ chứa dung môi nồng độ tương ứng. Nồng độ Chlorophyll a (Chl-a) và nồng độ Chlorophyll b (Chl-b) được tính theo công thức:
[Chl-a] = 0,0127 x A664 – 0,00269 x A646
[Chl-b] = 0,0229 x A646 – 0,00468 x A664
Đối với dung môi methanol và ethanol, mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 665 và 652 nm (Zapata, Garrido, & Jeffrey, 2006). Mẫu trắng (blank) là mẫu chỉ chứa dung môi nồng độ tương ứng. Nồng độ Chlorophyll a (Chl-a) và nồng độ Chlorophyll b (Chl-b) được tính theo công thức:
[Chl-a] = 16,29 x A665 – 8,54 x A652
[Chl-b] = 30,66 x A652 – 13,58 x A665
[Chl-ab] = 22,12 x A652 + 2,71 x A665
2.2.5. Phương pháp xử lý tảo Spirulina trước khi chiết Chlorophyll bằng bộ chiết Sohxlet
Lấy 300 tảo bột Spirulina vào trong mỗi ống lọc giấy cùa bộ chiết Sohxlet (ϕ8 cm X cao 32,5 cm). Đặt ống trong cốc 250 ml, thêm acetone vào đáy cốc và phần trên của bộ lọc Sohxlet cho đến khi acetone thấm toàn bộ bột Spirulina bên trong ống (hết khoảng 500 ml acetone). Ngâm ống lọc chứa Spirulina vào trong ống chứa Nito lỏng, đồng thời tiếp tục thêm nito lỏng sao cho lượng nito lỏng ngập toàn bộ ống lọc (lượng Nito lỏng khoáng 2,5L.).
Sau 15 phút, ống lọc đã sẵn sàng cho giai đoạn tiếp theo.
2.2.6. Phương pháp chiết Chlorophyll từ tảo bột Spirulina bằng hệ thống chiết Sohxlet
Đặt ống lọc trên vào trong hệ thống chiết Sohxlet, để yên cho ống lọc trở về nhiệt độ 10-20oC. Thêm acetone (2L) vào bình cầu ở dưới. Hệ thống được khởi động và tảo bột Spirulina được chiết 24h bằng acetone trong môi trường khí nito, hạn chế ánh sáng (khoảng 20-25 phút/1 vòng tách chiết, tổng số khoảng 75 vòng tách chiết). Sau khi để nguội, dịch chiết acetone được lọc qua bông dần dần vào bình cầu dung tích 1L. Cất quay chân không để thu hồi dung môi acetone. Sau khi không còn acetone ngưng tụ, thêm 2 lần Dichloromethane (2x100 ml) vào bình chứa dịch chiết cô đặc và tiếp tục cất quay chân không để loại bỏ nước còn lẫn trong hỗn hợp. Hỗn hợp được tiếp tục cất quay ở áp suất thấp để loại bỏ phần dầu có trong hỗn hợp, sản phẩm được gọi là hỗn hợp Chlorophyll cô đặc ở dạng dầu sệt (khoảng 30-35g/1 lần tách chiết Sohxlet). Hỗn hợp này được tiếp tục chuyển hóa thành Methyl pheophorbide a ở bước sau.
2.2.7. Phương pháp tinh chế lượng nhỏ Chlorophyll a
Lấy 1 g hỗn hợp sản phẩm thô, hòa tan trong 3ml CH2Cl2. Chuẩn bị cột sắc ký Alox (100 g, mesh 100 – 300), dung môi n-hexane. Bọc kín cột bằng màng nhôm tránh ánh sáng. Chuyển hỗn hợp 1g sản phẩm thô trong CH2Cl2 lên đầu cột, dùng dung môi n-hexane để chạy cột đến khi thu được dung dịch trong suốt. Thay đổi tỷ lệ n-hexane: acetone để tăng tính phân cực và chạy đến khi phần màu xanh trên cột dịch chuyển dần ra khỏi cột. Lấy các phân đoạn của dung dịch rửa giải và kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng (SiO2, n- hexane: EtOAc: Acetone: methanol = 7,6:1:1:0,4). Gộp các phân đoạn màu xanh có kết quả sắc ký bản mỏng tốt, làm bay hơi dung môi bằng cách thổi khí N2 ở nhiệt độ phòng thu được Chlorophyll a sạch (15 – 20 mg). Hạn chế ánh sáng bằng cách bọc kín bình chứa Chlorophyll a bằng giấy nhôm và bảo quản trong tủ lạnh.
2.2.8. Phương pháp điều chế Methyl Pheophorbide a từ Chlorophyll a Thêm methanol khan (500 mL) vào bình cầu dung tích 1L chứa hỗn hợp Chlorophyll cô đặc (30-35g) ở trên và con từ. Vừa khuấy hỗn hợp vừa nhỏ từ từ axit sulfuric đặc (25 mL) qua 1 phễu nhỏ giọt vào hỗn hợp phản ứng sao cho nhiệt độ bình phản ứng không quá 40oC. Hỗn hợp được khuấy qua đêm ở nhiệt độ phòng trong môi trường khí nito.
Hỗn hợp phản ứng sau đó được chuyển sang phễu chiết dung tích 2L có chứa dichloromethane (400 mL), nước (800ml). Tiếp tục chiết 02-03 lần bằng dichloromethane (3x200ml). Pha hữu cơ được gộp lại và lọc qua bông vào một bình cầu. Cất quay chân không để loại dung môi, thu hỗn hợp sản phẩm methyl pheophorbide a thô màu đen (khoảng 25-30g).
2.2.9. Phương pháp tinh sạch methyl pheophorbide a Quy trình tách cột
Quy trình này được thực hiện cho sản phẩm tách chiết và chuyển hóa từ 1 lần chiết Sohxlet (700g/l mẻ/l Sohxlet):
Chuẩn bị cột sắc ký: cho vào cột sắc ký thủy tinh (ϕ65 mm, khóa Teflon), một miếng bông nhỏ phía trên phần khóa, thêm một ít cát sạch (50- 70 mesh) phía trẻn phần bông, sau đó thêm từ từ 400g Silica gel (60Ǻ, 230- 400 mesh) vào trong cột, gõ nhẹ cột dể bột Silica gel ồn định. Từ từ thêm vào từ phía trên cột dung môi n-hexane, đồng thời mở khóa cột để dung môi chảy qua hết phần Silica gel trong cột và đi ra phía đầu cột. Gõ cột và để cột ổn định trong khoảng 15 phút.
Hòa tan hỗn hợp methyl pheophorbide a thô (25-30g) trong dichloromethane, sau dó dùng pipet pasteur hút và từ từ chuyển lên dầu cột, chú ý không làm bề mặt silica gel bị tác động, phân tán. Mở khóa cột để phần dung dịch chứa hỗn hợp methyl pheophorbide a chạy vào đầu cột.
Thay hệ dung môi rửa giải sang hỗn hợp (n-hexane: dichloromelhane
= 1:1), tiến hành chạy cột cho đến khi dung dịch rửa giải không còn màu vàng đó (tổng thể tích hệ dung môi sử dụng khoảng 06 lit, có thể quay vòng hệ dung môi bằng cất quay chân không để tiết kiệm).
Sau đó chuyển dung môi rửa giải sang dichloromethane, tiếp tục tiến hành chạy cột, bỏ phân đoạn màu vàng đậm đi ra khỏi cột, sau đó đến phân đoạn màu xanh đen chứa sản phẩm Methyl pheophorbide a. Lấy phần dung dịch rửa giải này (khoảng 250 ml/l làn) vào các bình cầu 500 ml (1/2 bình), đánh số thứ tự. Kiểm tra sắc ký bản mỏng so sánh với chất mẫu methyl pheophorbide a. Gom các phân đoạn có sản phẩm tương đối sạch, cất loại dung môi dichloromethane, thu sản phẩm methyl pheophorbide a ở dạng rắn.
Kết tinh lại trong hệ dung môi (dichloromethane: methanol 1,5: 10) thu được khoảng 3 g methyl pheophorbide a sạch (hiệu suất khoảng 0,43% theo khối lượng sinh khối tảo.