4.1. VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA ANDIABET
4.1.2. Về độc tính bán trường diễn của Andiabet
Vinabetes là dạng cao mềm có thành phần tương tự Andiabet đã được nghiên cứu về độc tính bán trường diễn trên thỏ trong 4 tuần với 2 liều 1,8 g/kg/ngày và 3,6 g/kg/ngày. Kết quả từ nghiên cứu này cho thấy Vinabetes tuy không ảnh hưởng đến tình trạng chung, sự gia tăng thể trọng thỏ, chức năng hệ thống tạo máu, chức năng gan, cấu trúc và chức năng thận thỏ, nhưng trên vi thể có tổn thương tế bào gan ở các mức độ khác nhau. Do tổn thương này không trùng hợp với sự thay đổi các chỉ số sinh hóa nên chưa khẳng định chắc chắn được tổn thương trên cấu trúc gan [48]. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu độc tính bán trường diễn của Andiabet với thời gian kéo dài hơn nhằm tìm kiếm những tổn thương do độc tính của thuốc gây ra. Theo WHO nghiên cứu độc tính bán trường diễn đường uống trên động vật gặm nhấm với liều lặp lại trong thời gian 90 ngày sẽ cung cấp những thông tin về các độc tính chính, chỉ ra các cơ quan đích bị tổn thương và khả năng tích lũy thuốc, cũng như có thể xác định mức độ tác dụng có hại không quan sát được của chế phẩm thử, thiết lập các tiêu chí an toàn cho người sử dụng [115]. Căn cứ hướng dẫn thử độc tính bán trường diễn các thuốc từ dược liệu của WHO, chúng tôi tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn của chế phẩm thử trên thỏ trong 90 ngày liên tục với 2 liều: Andiabet liều 0,21 g/kg/ngày (tương đương liều dự kiến dùng trên người) và Andiabet liều 0,64 g/kg/ngày (tương đương liều gấp 3 lần liều dự kiến dùng trên người). Độc tính của thuốc (nếu có) sẽ ảnh hưởng đến tình trạng toàn thân, ảnh hưởng đến một số chức năng và hình thái cấu trúc của các cơ quan chính trong cơ thể. Từ kết quả thực nghiệm cho thấy:
4.1.2.1. Tình trạng chung và sự thay đổi cân nặng cơ thể thỏ:
Trong suốt thời gian 90 ngày uống thuốc, theo dõi thấy các thỏ vẫn tỉnh táo, nhanh nhẹn, ăn, uống và các hoạt động khác vẫn bình thường. Về cân nặng, sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống chế phẩm thử, cân nặng của thỏ ở các lô điều trị bằng Andiabet đều tăng so với trước nghiên cứu và không có sự khác
biệt so với lô chứng (p > 0,05), (bảng 3.2). Thỏ dùng trong nghiên cứu là thỏ đã trưởng thành, trên 3 tháng tuổi, đạt cân nặng ổn định từ 2-2,5 kg, vì thế cân nặng duy trì ở mức độ trên là hoàn toàn phù hợp với sinh lý phát triển. Nếu cân nặng của thỏ giảm đi hoặc thể trạng chung thay đổi trong quá trình nghiên cứu thì có thể là hậu quả của sự tác động tiêu cực của thuốc thử [147]. Như vậy bước đầu cho thấy Andiabet không ảnh hưởng đến quá trình hoạt động và tăng trưởng bình thường của thỏ.
4.1.2.2. Ảnh hưởng của Andiabet đến chức năng tạo máu:
Máu là một tổ chức quan trọng có liên quan mật thiết với mọi cơ quan trong cơ thể. Về mặt bệnh lý, máu chịu ảnh hưởng của tất cả các cơ quan đó, nhưng đồng thời cũng phản ánh tình trạng riêng của cơ quan tạo máu. Nếu thuốc có ảnh hưởng đến cơ quan tạo máu thì trước hết các thành phần của máu sẽ bị thay đổi. Theo WHO, đánh giá được càng nhiều thông số của máu càng có khả năng đánh giá chính xác độc tính của thuốc [147]. Vì vậy, để đánh giá ảnh hưởng của Andiabet đến cơ quan tạo máu, các xét nghiệm về số lượng hồng cầu, lượng huyết sắc tố, hematocrid, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu của thỏ thí nghiệm được tiến hành tại các thời điểm 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày sau uống chế phẩm thử.
Kết quả bảng 3.3 và bảng 3.4 cho thấy: số lượng hồng cầu, lượng hemoglobin, hematocrid, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu của các thỏ ở cả 2 lô thử uống Andiabet liều tương đương lâm sàng 0,21g/kg/ngày và liều gấp 3 lâm sàng 0,64g/kg/ngày đều không có sự khác biệt so với lô chứng và so sánh giữa các thời điểm trước và sau khi uống chế phẩm thử. Điều này cho thấy Andiabet không có độc tính với cơ quan tạo máu.
4.1.2.3. Ảnh hưởng của Andiabet đến chức năng gan thỏ
Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc đối với hệ thống gan mật là rất cần thiết
khi đánh giá độc tính của thuốc, nhất là các thuốc dùng dài ngày, vì gan là cơ quan chuyển hóa thuốc. Để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, 2 enzym thường được định lượng là AST (SGOT) và ALT (SGPT). Sự gia tăng hoạt độ các enzym này thường gắn liền với sự huỷ hoại tế bào gan do độc tính của thuốc.
Kết quả cho thấy sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống Andiabet ở cả 2 mức liều, hoạt độ AST và ALT không tăng cao trong huyết thanh (bảng 3.5), không có sự khác biệt so với lô chứng và so sánh giữa các thời điểm trước và sau khi uống chế phẩm thử. Điều này chứng tỏ chế phẩm thử không gây tổn thương cho tế bào gan.
Các chức năng khác của gan có thể được đánh giá gián tiếp thông qua một số xét nghiệm như: nồng độ bilirubin toàn phần, nồng độ albumin, nồng độ cholesterol toàn phần trong máu thỏ [154]. Kết quả ở bảng 3.5 đã chứng minh Andiabet liều 0,21 g/kg/ngày và liều 0,64 g/kg/ngày không làm ảnh hưởng đến chức năng gan, không có sự khác biệt so với lô chứng và so sánh giữa các thời điểm trước và sau khi uống chế phẩm thử (p > 0,05).
Nhằm đánh giá trực tiếp tổn thương tại gan, tất cả các thỏ thực nghiệm (gồm lô chứng và 2 lô thử) sau 90 ngày uống Andiabet đều được mổ để quan sát hình ảnh đại thể của gan cũng như các cơ quan: tim, phổi, lách, tuỵ, thận và hệ thống tiêu hoá. Quan sát cho thấy không có sự thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể tại tất cả các cơ quan đó. Tuy nhiên, tất cả các mẫu bệnh phẩm gan thỏ đều được gửi đến Trung tâm nghiên cứu và phát hiện sớm ung thư để làm xét nghiệm vi thể. Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 30% cấu trúc vi thể gan thỏ ở mỗi lô cho thấy: lô chứng và lô thử 1 có 1 mẫu (trong 3 mẫu bệnh phẩm) tế bào gan có hiện tượng thoái hóa nhẹ. Lô thử 2 có 2 mẫu (trong 3 mẫu bệnh phẩm) tế bào gan có hiện tượng thoái hóa nhẹ (Hình 3.1). Tuy có một vài tổn thương nhẹ
ở cấu trúc vi thể gan thỏ lô thử 1 và lô thử 2, nhưng không có sự khác biệt so
với lô chứng. Các biến đổi nhỏ này cũng chưa đủ để gây ra những thay đổi về sinh hóa chức năng gan. Tuy nhiên trong quá trình dùng thuốc dài ngày cần chú ý theo dõi chức năng gan và nên thận trọng với những bệnh nhân có tiền sử bệnh lý về gan.
4.1.2.4. Ảnh hưởng của Andiabet đến chức năng thận thỏ
Thận là cơ quan bài tiết của cơ thể, rất dễ bị tổn thương bởi các chất độc nội sinh và ngoại sinh. Do đó, khi đưa thuốc vào cơ thể, thuốc được thải trừ qua thận có thể gây độc, làm tổn thương thận, từ đó ảnh hưởng chức năng lọc cầu thận. Vì thế xét nghiệm cơ bản để đánh giá chức năng lọc của cầu thận thường được sử dụng là xét nghiệm creatinin máu [154].
Trong thực nghiệm của chúng tôi, sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống Andiabet, nồng độ creatinin không có sự khác biệt so với lúc trước dùng thuốc (bảng 3.6), chứng tỏ Andiabet không ảnh hưởng chức năng lọc cầu thận.
Đồng thời, quan sát không thấy có thay đổi nào về mặt đại thể thận thỏ cũng như các kết quả xét nghiệm vi thể thận thỏ cho thấy không có sự khác biệt về cấu trúc vi thể thận giữa 2 lô thử dùng chế phẩm thử Andiabet và lô chứng: cấu trúc vi thể của biểu mô thận, tế bào ống lượn gần hoàn toàn bình thường, tương tự như lô chứng, không thấy có các biểu hiện của tổn thương (hình 3.2). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với xét nghiệm đánh giá chức năng thận: creatinin máu bình thường.
Các tác giả khác khi nghiên cứu độc tính bán trường diễn của từng dược liệu riêng rẽ cũng cho các kết quả tương tự: Phùng Thanh Hương nghiên cứu độc tính bán trường diễn của dịch chiết lá Bằng lăng nước liều 4,55 g và liều 13,65 g dược liệu khô/kg đường uống trên thỏ sau 4 tuần không làm thay đổi tình trạng chung, cân nặng, chức năng tạo máu, chức năng gan, thận thỏ [66]. Đào Văn Phan và cộng sự nhận thấy thỏ uống dịch chiết Giảo cổ lam liều 400 g/kg trong 2 tháng không có sự thay đổi về chức phận cơ bản của gan, thận
[136]. Khi nghiên cứu độc tính bán trường diễn của dịch chiết nước Giảo cổ lam đã được chuẩn hóa chứa 6% gypenosid, Chiranthanut N và cộng sự đã cho
chuột cống uống dịch chiết với liều 1000 mg/kg/ngày trong 90 ngày, sau đó theo dõi thêm 28 ngày nữa sau 90 ngày điều trị. Kết quả là dịch chiết Giảo cổ lam không gây tử vong hay có bất kỳ sự bất thường nào ở chuột. Mặc dù một số xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu (như bạch cầu trung tính, monocyte, glucose, và mức phosphatase kiềm huyết thanh) có sự khác biệt về mặt thống kê so với nhóm chứng, tuy nhiên những giá trị này vẫn nằm trong phạm vi bình thường [153].
Như vậy kết quả thử độc tính bán trường diễn trong nghiên cứu này cho thấy Andiabet liều 0,21 g/kg/ngày và liều 0,64 g/kg/ngày không gây độc cho thỏ sau 90 ngày liên tục uống thuốc. Kết quả này cũng loại trừ sự nghi ngờ của Bùi Thị Quỳnh Nhung về tổn thương vi thể gan thỏ khi nghiên cứu độc tính bán trường diễn của Vinabetes [48]. Kết quả nghiên cứu này hứa hẹn cho việc sử dụng chế phẩm thử trên người. Điều này có cơ sở thực tế vì Bằng lăng nước, Giảo cổ lam và Tri mẫu đều được biết đến như là những loại thảo dược an toàn, đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian mà không thấy phản ứng bất lợi nào.
4.2. TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU VÀ MỘT SỐ CƠ CHẾ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CỦA VIÊN ANDIABET TRÊN THỰC NGHIỆM 4.2.1. Tác dụng hạ glucose máu của viên Andiabet trên chuột nhắt trắng bình thường.
Một số nghiên cứu đã đưa ra nhận định Giảo cổ lam, Bằng lăng nước và Tri mẫu có khả năng làm hạ glucose máu trên chuột bình thường. Đào Văn Phan và cộng sự nghiên cứu dịch chiết cồn toàn phần của Giảo cổ lam nhận thấy: Giảo cổ lam có tác dụng hạ glucose máu yếu trên chuột nhắt trắng bình thường, nhưng lại có tác dụng khá mạnh trên chuột có đường huyết cao [136].
Noberg A., Nguyễn Khánh Hòa và cs (2004) [112] đã chứng minh Phanosid
một saponin damaran mới, chiết xuất từ cây Giảo cổ lam có tác dụng làm hạ glucose máu trên chuột cống bình thường khi cho uống liều 40 mg/kg và khẳng định tác dụng đó là do kích thích tuyến tụy bài tiết insulin. Phùng Thanh Hương nghiên cúu về tác dụng hạ glucose máu của Bằng lăng nước thấy: dịch chiết ethanol liều tương đương 18,2 g dược liệu khô/kg cho chuột nhắt trắng bình thường uống sau 4 giờ đã làm hạ glucose máu là 35,01% [66].
Còn Đào Văn Phan, Nguyễn Khánh Hoà, Nguyễn Duy Thuần thấy dịch chiết ethanol của Tri mẫu 1500 mg/kg đường uống có tác dụng làm hạ glucose máu trên chuột nhắt trắng sau 4 giờ [136]. Nguyễn Thị Hương Giang nghiên cứu Mangiferin chiết xuất từ Tri mẫu nhận thấy Mangiferin liều 100mg/kg làm hạ glucose máu 15,56% (p > 0,05) và liều 200mg/kg làm hạ glucose máu là 23,85% (p < 0,05) so với lô chứng và tác dụng này kéo dài trên 7 giờ ở chuột nhắt trắng bình thường sau 7 ngày uống thuốc liên tục [143].
Như vậy trong các nghiên cứu riêng rẽ nói trên, dịch chiết của Giảo cổ lam, Bằng lăng nước và Tri mẫu, cũng như các hoạt chất chính trong các dược liệu đó đều thể hiện tác dụng hạ glucose máu trên chuột bình thường, sau 4 giờ uống thuốc và sau uống liên tục 7 ngày, mức hạ glucose máu dao động nhiều trong khoảng từ 15-35% và phụ thuộc liều dùng. Cũng như vậy khi cho chuột nhắt trắng uống cao mềm Vinabetes (hỗn hợp dịch chiết của Giảo cổ lam, Bằng lăng nước và Tri mẫu) trong 4 tuần liên tục với liều 4,5 g/kg và 9 g/kg, sau 2 tuần nồng độ glucose máu giảm lần lượt là 18,7 % và 22,7 %, còn sau 4 tuần nồng độ glucose máu giảm rõ rệt lần lượt là 34 % và 44% [56].
Tương tự như vậy, kết quả từ bảng 3.7 cho thấy viên Andiabet có tác dụng hạ glucose máu trên chuột nhắt trắng bình thường. Sau 2 tuần liên tục uống chế phẩm thử, mức hạ glucose máu so với lô chứng của Andiabet liều 0,68 g/kg/ngày là 14,3% và của Andiabet liều 2 g/kg/ngày là 17,1%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Gliclazid làm hạ glucose máu ở cả 2 thời
điểm xét nghiệm là sau 1 tuần và 2 tuần uống thuốc, với mức hạ glucose máu từ 17,44 – 20,52 %. Gliclazid là một thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 thuộc nhóm sulfonylurea, thế hệ 2 làm hạ glucose máu theo cơ chế chính là kích thích tuyến tụy bài tiết insulin [15], do vậy được sử dụng làm chứng dương trong thí nghiệm này. Có thể nhận thấy Andiabet làm hạ glucose máu yếu hơn so với gliclazid trên chuột nhắt trắng bình thường, vì cả 3 loại thảo dược Giảo cổ lam, Bằng lăng nước và Tri mẫu đều chứa nhiều hoạt chất với các cơ chế hạ glucose máu khác nhau, không chỉ đơn thuần kích thích tuyến tuỵ tăng bài tiết insulin như gliclazid, mà có thể còn tác động hạ glucose máu theo nhiều cơ chế khác như làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin, ức chế gan tân tạo glucose, tăng tổng hợp glycogen ... và các tác dụng đó lại không thể hiện trên chuột nhắt trắng bình thường. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu của Andiabet trên mô hình gây ĐTĐ typ 2.