CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.4. Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.4.6. Môi trường nuôi cấy
1.4.6.1. Thành phần của môi trường
Thành phần môi trường nuôi cấy mô - tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy khác nhau thì môi trường nuôi cấy khác nhau cũng khá cơ bản.
Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhưng môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:
* Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lượng và vi lượng) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
- Trong muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung cấp là: Nitơ, phospho, kali và sắt.
+ Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng nitrat (NO3-) với hàm lượng ≈ 25 mM và amon (NH4+) với hàm lượng từ 2 - 20 mM.
+ Phospho thường được đưa vào môi trường ở dạng muối phosphat, hai loại hợp chất hay được dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lượng phospho trong môi trong môi trường nuôi cấy từ 0,15 - 0,40 mM.
+ Kali được cung cấp cho môi trường nuôi cấy dưới dạng KNO3, KCl và KH2PO4. Nồng độ kali sử dụng từ 2 - 25 mM.
- Yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy khá phức tạp và ít được nghiên cứu. Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy. Đây là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ nhỏ hơn 30 ppm, chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme.
+ Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia.
+ Bo: thiếu Bo trong môi trường nuôi cấy thường gây lên biểu hiện thừa Auxin. Mô nuôi cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hóa mạnh nhưng thường là mô xốp, mọng nước, kém tái sinh...
* Thành phần hữu cơ
- Vitamin, aminoaxit, amit, myo - inositol:
+ Vitamin: Các vitamin hay được sử dụng là các vitamin nhóm B (B1, B3, B6), ngoài ra môi trường nuôi cấy còn sử dụng một số vitamin khác như vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E... với các nồng độ khác nhau.
+ Myo-inositol là một loại đường - rượu liên quan đến quá trình tổng hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng trong tế bào, tham gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường và trao đổi hydratcacbon. Hàm lượng sử dụng là 100 mg/l môi trường [11].
+ Các aminoaxit và amit: Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường phải được bổ sung các aminoaxit, amit... vì chúng có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái. Theo Skoog & Milles (1957) tất cả các dạng tự nhiên của aminoaxit (dạng L) dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ, L-arginin dùng cho nuôi cấy rễ, L- tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi, L- serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn. Nồng độ sử dụng mỗi loại 10 - 100 mg/l [11].
- Thành phần hữu cơ phức hợp: Được dùng trong môi trường nuôi cấy để cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất...Chúng được sử dụng khi môi trường khoáng xác định không đạt kết quả mong muốn về sinh trưởng và phát triển của mẫu nghiên cứu. Một số chất được sử dụng phổ biến là:
Cazein thuỷ phân, dịch chiết nấm men, dịch chiết hoa, củ, quả,...
* Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu được trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy.
- Nhóm Auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính...
(Epstein&cs, 1989).
Các loại auxin thường sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid) + IBA (Indole butyric acid) + NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α- NAA (α- Naphthalene acetic acid) + 2.4 D (2.4 diclorophenoxy acetic acid)... IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm lượng cao 1,0 - 3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999). Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,1 - 2,0 mg/l.
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1962). Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy. Các loại cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô là:
+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine).
+ Kinetin (6-furfurylamino purine) + BAP (Bezylamino purine).
+ TDZ (Thidiazuzon).
Hàm lượng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/l. Ở những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại cytokinin nói trên, kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả. Đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tỷ lệ khác nhau.
- Nhóm Gibberellin: Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô người ta còn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy...GA3 là loại Gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất. Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên phải lọc qua màng lọc vô trùng rồi mới đưa vào môi trường.
* Nguồn cacbon Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp nhưng ở cường độ rất thấp. Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy. Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường saccharose với hàm lượng từ 2 - 6% (W/v). Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol rất ít dùng. Hàm lượng đường thấp được sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần, ngược lại hàm lượng đường cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi.
* Các thành phần khác
- Tác nhân tạo gel quyết định trạnh thái vật lý của môi trường nuôi cấy.
Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là agar. Nồng độ agar sử dụng từ 0,5 - 10 % (W/v) tuỳ theo chất lượng của chúng và môi trường sử dụng. Khi môi trường nuôi cấy là môi trường lỏng hoặc bán lỏng thì không hoặc bổ sung rất ít agar.
- Than hoạt tính được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp...Trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào môi trường, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do môi trường trở nên sẫm vì vậy có thể kích thích quá trình tạo rễ, một số trường hợp còn có tác dụng thúc đẩy phát sinh phôi vô tính và kích thích sinh trưởng phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ [11]. Nhưng than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng, nồng độ than hoạt tính thường sử dụng từ 0,2 - 0,3(W/v) [11].
1.4.6.2. pH của môi trường
pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 - 6,0 pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng. Nếu trong môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc quá axit thì GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính.
1.4.6.3. Tính thẩm thấu của môi trường
Hấp thụ nước của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy bị chi phối bởi thế năng của nước trong dịch bào và trong môi trường dinh dưỡng. Các thành phần chính có ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường bao gồm: Hàm lượng
đường, hàm lượng agar, một số thành phần muối khoáng. Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy đồng thời còn tham gia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường. Hàm lượng đường cao, mô nuôi cấy khó hút được nước. Hàm lượng đường thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng thuỷ tinh hóa ở mẫu nuôi cấy, đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm hoặc đồng ruộng.