2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Lá cây Sa kê được thu hái tại thành phố Đà Nẵng. Mẫu được xác định bằng việc khảo sát đặc điểm hình thái thực vật học dựa trên quan sát cây tươi. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phòng Thí nghiệm Di truyền – Giải phẫu sinh lý động vật, khoa Sinh – Môi trường, đại học Sư Phạm, Đà Nẵng.
2.1.2. Đối tượng động vật
Chuột nhắt trắng dòng Swiss có khối lượng từ 20-25 gram, chỉ gồm giống đực, được cung cấp bởi Viện Pasteur Nha Trang và được nuôi trong phòng thí nghiệm Di truyền – Giải phẩu – Sinh lý động vật thuộc khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tự do.
2.1.3. Nguyên liệu hóa chất
Methanol, aspirin, carrageenan, formaldehyt, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), ethanol 95%, axit ascobic và các hóa chất thông thường khác.
2.1.4. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu được tiến hành trên lá Sa kê thu hái tại thành phố Đà Nẵng. Hoạt tính kháng viêm của cao chiết lá Sa kê được đánh giá thông qua các phép thử hoạt tính in vitro, in vivo trên chuột nhắt trắng tại phòng thí nghiệm Di truyền – Giải phẫu – Sinh lý động vật thuộc khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khảo sát nồng độ gây độc tính cấp của cao chiết lá Sa kê.
- Đánh giá hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ lá Sa kê trên chuột nhắt trắng thông qua tỉ lệ % mức độ ức chế phù ở chân chuột nhắt trắng.
- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết lá Sa kê và xác định IC50.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Nghiên cứu những tài liệu liên quan làm cơ sở lý luận cho đề tài. Các tài liệu nghiên cứu gồm:
- Tài liệu nghiên cứu về quá trình viêm và các phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng viêm.
- Tài liệu nghiên cứu về chuột nhắt trắng.
- Tài liệu nghiên cứu về gốc tự do, stress oxy hóa và các phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa.
- Tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính của cây Sa kê.
2.3.2. Phương pháp chiết dịch nghiên cứu
Lá cây Sa kê sau khi được thu hái tại thành phố Đà Nẵng, được rửa sạch, phơi trong bóng râm đến khô, xay nhỏ làm nguyên liệu cho quá trình thu chiết cao.
Lá Sa kê được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt bằng methanol. Dịch chiết sau khi ngấm kiệt được thu hồi dung môi bằng cô quay chân không với nhiệt độ 55 ºC, áp suất 37 atm để tạo cao chiết.
2.3.3. Phương pháp thử độc tính cấp
Xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành. Cụ thể là cao chiết được pha ở nồng độ gốc 20 gram/ml (có thể đạt được do mẫu cao chiết) nhằm khảo sát độc tính cấp. 30 chuột chia thành 5 nhóm (6 con chuột/nhóm) gồm 1 nhóm đối chứng sinh lí, 4 nhóm thí nghiệm và bị bỏ đói hoàn toàn 16h trước khi cho uống mẫu. Mẫu được cho uống với liều cao nhất có thể và giảm dần, cụ thể là 10; 5; 2,5 và 1,25 gram/kg thể trọng. Sau khi cho uống cao chiết với một liều duy nhất từ 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô và tính giá trị LD50.
Xác định LD50 được tiến hành theo phương pháp của Karber như sau:
LD50 = LD - Σab/n.
Trong đó: LD50 là liều chết 50% động vật thí nghiệm;
LD là liều gây chết 100% động vật thí nghiệm;
n là số động vật trong một nhóm;
a là sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp;
b là tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp. Đồng thời, chuột chết sẽ được mổ để xét nghiệm đại thể;
2.3.4. Phương pháp gây viêm cấp
Gây viêm cấp bằng mô hình gây phù chân trên động vật thực nghiệm Chuột nhắt trắng chia thành 4 lô. Mỗi lô 5 con
- Lô 1 lô chứng trắng: uống NaCl 1%
- Lô 2 (lô chứng dương) uống aspirin (hoặc indomethacin với liều 10mg/kg P - Lô 3, 4 (lô thử nghiệm): uống dịch chiết lá Sa kê với các liều khác nhau Chuột được uống thuốc hai lần, lần thứ nhất trước khi gây viêm một ngày, lần thứ hai trước khi gây viêm một giờ. Tiến hành gây viêm bằng cách tiêm 0,1ml carrageenan 1% (pha trong nước muối sinh lý) vào gan bàn chân sau, bên phải chuột.
Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) vào các thời điểm: trước khi gây viêm, sau khi gây viêm 2h, 4h, 6h, 24h
Kết quả thu được được tính toán theo công thức của Fontaine Độ tăng thể tích chân chuột được tính theo công thức:
V(%)= [(Vt – V0)/V0]x100 Trong đó:
V0: thể tích chân chuột trước khi gây viêm Vt: thể tích chân chuột sau khi gay viêm
V: độ tăng thể tích chân chuột
Tác dụng chống viêm cấp của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù:
I%= [(Vc% - Vt%)]/ Vc%]x100 Trong đó:
Vc%: giá trị trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô đối chứng (%)
Vt%: giá trị trung bình độ tăng thể tích chân chuột lô thử (%)
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH [33, 36]
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu.
Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang phổ ở bước sóng λ = 515 nm.
*Cách tiến hành:
- 19,7mg DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) được hòa tan trong 500 ml ethanol 95% và được giữ trong ống nghiệm phủ ngoài bằng giấy bạc.
- 10mg cao chiết lá sake được pha trong 100ml ethanol 95% nồng độ dung dịch gốc của cao chiết là 100g/ml. Từ dung dịch có nồng độ 100g/ml pha thành các các dung dịch có nồng độ lần lượt là 40, 60, 80, 100g/ml.
- 10mg dịch chiết được pha trong trong 10ml ethanol 95%, nồng độ của dịch chiết gốc này là 1000g/ml. Từ dung dịch này pha thành dung dịch ở các nồng độ 150 và 200g/ml.
- Axit ascobic được pha ở các nồng độ 100; 50; 25; 12,5 và 6,26g/ml được sử dụng làm đối chứng tham khảo với nước cất.
- Cho vào ống nghiệm 3ml mẫu nghiên cứu. Thêm vào mỗi ống nghiệm 3ml dung dịch DPPH.
- Ống không có mẫu thử cho 3ml ethanol 95% và 3 ml DPPH làm đối chứng.
- Ủ các ống nghiệm chứa dịch nhiên cứu trong vòng 30 phút.
- Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng 515nm trong máy quang phổ.
Khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do (Scavenging Activities - SA) của các mẫu thử được tính như sau:
% SA = (ODđối chứng – ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%) Trong đó: ODđối chứng : Độ hấp thụ tại ống không chứa chất thử ODmẫu thử : Độ hấp thụ tại ống chứa chất thử
Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết được biểu hiện ở dưới dạng nồng độ ức chế (IC50). Giá trị IC50 được định nghĩa là nồng độ của dịch chiết ức chế sự hình thành các gốc DPPH 50%. Các giá trị IC50 được tính toán bằng phương pháp phân tích hồi quy tuyến tích.
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsoft excel. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng (M ± SD) & (M ± SE). Đánh giá, so sánh giá trị trung bình giữa các lô thí nghiệm bằng phương pháp thống kê sử dụng chuẩn t- Student. Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN