Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Thiết kế tái tổ hợp mất gen ncsB3 ở chủng S.carzinostaticus
3.1.6. Chuyển tổ hợp gen vào S.carzinostaticus
Chuyển gen vào tế bào xạ khuẩn là một công việc hết sức khó khăn đòi hỏi phải khảo sát các điều kiện thích hợp nhất có ảnh hưởng đến sự chuyển gen như: các điều kiện vi sinh vật, nồng độ lyzozyme ủ và thời gian xử lý, nồng độ PEG thêm vào khi chuyển gen, nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc đã được chuyển thành công.
Để tìm được điều kiện phù hợp cho sự thành công tạo tế bào tái tổ hợp các thí nghiệm khảo sát về các yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến hiệu suất chuyển gen đó là: Thời gian ủ lysozim để loại bỏ lớp thành tế bào (petidoglycon) từ 30 đến 70 phút; nồng độ PEG xúc tác cho quá trình chuyển gen từ 10 đến 50% và nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen từ 10 đến 20 àg.ml-1
Qua kết quả khảo sát tìm các điều kiện thích hợp nhất để chuyển gen vào tế bào xạ khuẩn cho thấy thời gian xử lý lysozim trong 30 phút là thích hợp nhất để cho được số tế bào trần có tỷ lệ sống cao và có thể là tế bào khả biến thích hợp.
Với nồng độ khỏng sinh neomycin được xỏc định là 50 àg/ml để với các mẫu chuyển gen để lựa chọn các khuẩn lạc đã thành công (chủng tự nhiên S.carzinostaticus ATCC15944 bị ức chế không phát triển được).
Tương tự như vậy với nồng độ PEG thích hợp là 30% và với nồng độ kháng sinh phủ lên đĩa chuyển gen là tỷ lệ tế bào đã được nhận vector tái tổ hợp (tế bào tái tổ hợp đạt cao nhất). Các khuẩn lạc đã mọc tốt sau chuyển gen 36 giờ (Hình 3.11).
Hình 3.11. Các khuẩn lạc phát triển trên đĩa thạch sau khi chuyển gen 36 giờ.
3.1.6.2. Sàng lọc đột biến kép mất gen ncsB3
Để lựa chọn ra được khuẩn lạc có đột biến kép mất hoàn toàn ncsB3, các khuẩn lạc được lựa chọn sẽ được nuôi cấy trong môi trường dịch R2YE bổ sung 50 àg/mlneomycin và nuụi cấy ở nhiệt độ 37°C. Cỏc sợi xạ khuẩn được pha loãng với các nồng độ 1/103, 1/104, 1/105 và 1/106 sau đó dàn đều trên đĩa thạch R2YE không có kháng sinh và ủ ở tủ ấm vô khuẩn 28°C.
Sau khoảng 60-72 giờ xuất hiện các khuẩn lạc tiến hành lấy ngẫu nhiên khoảng 500 khuẩn lạc cấy đồng thời trên 2 môi trường khác nhau là đĩa thạch R2YE bổ sung 50àg/ml neomycin và đĩa thạch R2YE bổ sung 20 àg/ml apramycin (R2YE/Neo50, R2YE/Apr20) (Hình 3.12). Khuẩn lạc nào có cả gen kháng neomycin và gen nhạy cảm với apramycin (neor.aprs) sẽ là các khuẩn lạc tiềm năng cho việc lựa chọn chủng đột biến kép mất gen ncsB3 hoàn toàn trong genome.
Hình 3.12. Các khuẩn lạc được cấy riêng rẽ trên đĩa R2YE/Neo50 và R2YE/Apr20
Trong số khoảng hơn 500 khuẩn lạc được lựa chọn ngẫu nhiên và nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch ở cả 2 loại đĩa (R2YE/Neo50, R2YE/Apr20). Ở thế hệ thứ 5 đã phát hiện ra 2 khuẩn lạc phát triển rất tốt ở môi trường R2YE/Neo50 nhưng không mọc trong môi trường R2YE/Apr20.
Khi nuôi cấy 2 khuẩn lạc này ở trong môi trường lỏng R2YE có kháng sinh với nồng độ tương ứng cũng thu được kết quả tương tự, đó là chủng đột biến chỉ sinh trưởng trong mụi trường cú chứa neomycine 50àg/ml và khụng phỏt triển trong mụi trường cú chứa apramycine 20àg/ml (Hỡnh 3.13).
Hình 3.13. Hai khuẩn lạc được nuôi cấy trong môi trường lỏng R2YE/Neo50, R2YE/Apr20
Apr 20àg/ml Neo 50àg/ml Neo 50àg/ml Apr 20àg/ml
Điều đó chứng tỏ rằng trong genome của chủng đột biến đã chứa gen kháng kháng sinh neomycine (neor) và không còn vector pKC1139 nữa. Để khẳng định sự thành công của chủng đột biến chúng tôi dùng kỹ thuật PCR để kiểm tra kết quả của thí nghiệm.
3.1.6.3. Chứng minh sự mất gen hoàn toàn ncsB3 trong chủng đột biến
Hai khuẩn lạc được giả định là chủng đột biến mất gen ncsB3 được nuôi cấy để tách DNA tổng số và được làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR. Khi sử dụng cặp mồi của gen kháng neomycin (neor) và cặp mồi của gen kháng apramycin (aprr) (Bảng 2.1) cho thấy sản phẩm PCR chỉ xuất hiện ở cặp mồi của gen kháng neomycin (~1kb) tuy nhiên không thấy sản phẩm PCR đối với cặp mồi thiết kế cho gen kháng apramycine (Hình 3.14). Điều này chứng tỏ gen neor đã được chèn vào genome của chủng S.carzinostaticus trong khi đó gen kháng apramycin (aprr) đã biến mất khỏi chủng đột biến hay nói một cách khác vector pKC1139 đã bị loại bỏ khỏi genome của chủng đột biến.
Điều đó chứng tỏ chủng đột biến tạo thành đã mất hoàn toàn ncsB3 và thay thế bởi gen kháng neomycin (neor).
Hình 3.14. Hình ảnh sản phẩm PCR với sự có mặt của gen kháng neomycin (neor) thay thế cho ncsB3
Apramycin M Neomycin