CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.2 Khảo sát điều kiện thủy phân
2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ chế phẩm enzyme (Anson, 1938)
Nguyên tắc: cho enzyme thủy phân cơ chất casein, acid amin Tyrosine được giải phóng cùng với các peptide và các acid amin khác. Xác định Tyrosine tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt tính enzyme theo định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính enzyme là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm
20
pH = 7,5, T = 37°C , thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong tricloro acetic acid (TCA), phản ứng với thuốc thử Folin, cho độ hấp thu ở bước sóng 660nm bằng với độ hấp thu của dung dịch L-Tyrosine 1M trên đường chuẩn [58].
Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục.
2.2.2.2 Phương pháp thủy phân
Phụ phẩm cá hồi được thủy phân sử dụng phương pháp của Bhaskar và Mahendrakar (2008) [59] với một vài thay đổi. Đầu tiên, phụ phẩm được trộn với nước theo tỷ lệ 1:10 (w/v) (giá trì này được chọn từ kết quả nghiên cứu trước, số liệu không trình bày trong nghiên cứu này) trước khi gia nhiệt lên 900C trong 15 phút để vô hoạt enzyme nội tại. Tiếp theo, pH của hỗn hợp được chỉnh đến giá trị mong muốn bằng dung dịch NaOH 1M hoặc dung dịch HCl 1M. Sau đó, chế phẩm enzyme được cho vào theo tỷ lệ E:S xác định và tiến hành thuỷ phân tại nhiệt độ và thời gian phù hợp. Sau quá trình thuỷ phân, dịch thuỷ phân được gia nhiệt ở 900C trong 15 phút để vô hoạt chế phẩm enzyme. Dịch thuỷ phân được ly tâm trước khi lọc qua giấy lọc Whatman paper no. 3 để tách loại bỏ phần rắn, thu lấy dịch thủy phân. Phần dịch được tiến hành sấy đông khô và bảo quản ở -40C.
Quy trình thu nhận dịch thủy phân từ phụ phẩm cá hồi được thể hiện trong hình 2.2.
21 Phụ phẩm chế biến
cá hồi
Xay nhuyễn
Vô hoạt enzyme nội tại
Chỉnh pH
Thủy phân
Vô hoạt enzyme
Ly tâm
Tách béo
Lọc
Dịch thủy phân Nước cất
Chế phẩm enzyme Dung dịch NaOH/HCl 1M
Béo
Bã
Tỷ lệ phụ phẩm:nước 1:10 (w/v) Nhiệt độ 900C
Thời gian 15 phút
Nhiệt độ 900C Thời gian 15 phút
Hình 2.2 Quy trình thu nhận dịch thủy phân từ phụ phẩm chế biến cá hồi
22
2.2.2.3 Phương pháp xác định mức độ thủy phân (Nielsen và cộng sự, 2001)
Nguyên tắc: phản ứng giữa nhóm amino và o-phthaldialdehyde (OPA) với sự có mặt của dithiothretiol (DTT) tạo thành hợp chất màu (xanh dương nhạt) có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 340nm [60].
Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục.
2.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến CaBC của dịch thủy phân Ảnh hưởng của điều kiện thủy phân gồm loại enzyme, pH, nhiệt độ, tỷ lệ E:S và thời gian thủy phân đến CaBC của dịch thủy phân được khảo sát sử dụng phương pháp thử đơn yếu tố thực hiện bằng cách thay đổi một yếu tố với nhiều mức độ khác nhau trong khi cố định các yếu tố khác.
Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi.
Yếu tố Enzyme pH Nhiệt độ
(oC)
Tỷ lệ E:S (U/g protein)
Thời gian (giờ)
Enzyme 4 loại
enzymes
Chọn giá trị tối ưu
Chọn giá
trị tối ưu 50 8
pH x Khoảng pH
tối ưu
Chọn giá
trị tối ưu 50 8
Nhiệt độ x x
Khoảng nhiệt độ tối
ưu
50 8
Tỷ lệ E:S x x x 40 - 80 8
Thời gian x x x x 6-10
x: Giá trị tốt nhất được chọn sau khi khảo sát
23
2.2.2.5 Phương pháp lọc khử khoáng dịch thủy phân
Dịch thuỷ phân sau quá trình lọc thô được đưa qua cột nhựa trao đổi ion (macroporous resin, Amberlite IRC-748I, dạng muối natri, Acros) để tiến hành lọc khử khoáng. Hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri (hình 2.3) sẽ trao đổi ion Na+ với các ion kim loại khác trong dịch thủy phân dựa trên sự khác biệt về ái lực của hạt nhựa đối với các ion này.
Hình 2.3 Công thức hóa học của hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri.
Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục.
2.2.2.6 Phương pháp xác định CaBC (Jung và cộng sự, 2006)
Nguyên tắc: ion canxi phản ứng với o-cresolphthalein complexone (o-CPC) trong môi trường kiềm để tạo thành một phức chất màu tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 570nm [40].
Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục.
2.2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan (Lowry và cộng sự, 1951).
Nguyên tắc: dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng ở bước sóng 660 nm, protein khử hỗn hợp phosphomolipdate – phosphovonphramate (thuốc thử Folin – Ciocalteau). Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein [61].