Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy in vitro (trong ống nghiệm) để phân biệt với nuôi cấy trong điều kiên tự nhiên ngoài ống nghiệm.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô để nhân giống thực vật. Nhờ áp dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng duy truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quý hiếm để phục hồi giống cây trồng.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:
₋ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
₋ Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, bao phấn, quả…
₋ Nuôi cấy phôi non và cây trưởng thành
₋ Nuôi cấy mô sẹo
₋ Nuôi cấy photoplast (nuôi cấy tế bào trần)
₋ Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
20
Hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô thực vật không những nhằm phục vụ các nghiên cứu cơ bản trong khoa học, mà còn hướng về những ứng dụng thực tiễn.
Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với các mục đích sau:
- Tạo một quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm soát.
- Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được.
- Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học.
- Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.
- Bảo quản nguồn gen quý.
1.2.2 Lợi ích của nhân giống in vitro
Theo Bùi Bá Bổng (1995) nhân giống in vitro có những ưu điểm sau:
₋ Tạo các cây con đồng nhất và giống cây mẹ.
₋ So với các kiểu nhân giống thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng lớn cây con từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn.
₋ Không chiếm nhiều diện tích.
₋ Có thể cung cấp cây giống bất cứ thời điểm nào vì chủ động được, do không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh.
₋ Có thể tạo và nhân được các giống mới bằng kỹ thuật cứu phôi, chuyển gene.
₋ Một số cây quí có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất và việc trao đổi giống được thực hiện dễ dàng.
1.2.3 Khó khăn trong nhân giống in vitro
Tuy nhân giống in vitro đạt được những thành tựu to lớn nhưng cạnh đó đã gặp không ít khó khăn, theo Nguyễn Văn Uyển và cộng sự (1984) thì có một số khó khăn sau:
₋ Nhân giống trên môi trường agar thì giá thành sản xuất vẫn còn cao và thời gian nhân giống dài.
21
₋ Khi sản xuất ở qui mô công nghiệp thì chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn ở mức cao.
₋ Đôi khi xảy ra biến dị soma trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt là tái sinh thông qua mô sẹo.
₋ Giới hạn sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thường đồng nhất về mặt di truyền.
₋ Quá trình nhân giống phức tạp.
1.2.4 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.4.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật
Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ những cơ quan, bộ phận của cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với cây mẹ.
1.2.4.2 Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau.
Phản phân hóa của tế bào là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia.
Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng…
1.2.5 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Dương Công Kiên (2002), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật như sau:
1.2.5.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Một trong những phương thức sinh trưởng để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên).
22
Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp…
Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường.
1.2.5.2 Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo.
1.2.5.3 Nuôi cấy tế bào đơn
Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn.
Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối.
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch. Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin – auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
1.2.5.4 Nuôi cấy protoplast
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.
23 1.2.5.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội
Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.
1.2.6 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1902, nhà thông thái Haberlanđt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể. Tuy nhiên, do tiến hành trên cây họ hòa thảo (cây một lá mầm) một loại cây khó thực hiện nên không thành công.
Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn, mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới.
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua (Lycopersicum esculentum). Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng.
Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công.
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi.
Từ năm 1954 đến năm 1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh.
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.
Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy.
24
Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa.
Năm 1962, Murashige và Skoong đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay.
Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm 1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá.
Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa.