Kỹ thuật phát sinh phôi soma, PLB chuẩn bị mẫu cho tạo hạt nhân tạo

Một phần của tài liệu Tổng quan về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan hồ điệp phalaenopsis sp (Trang 33 - 38)

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP

2.1. Kỹ thuật phát sinh phôi soma, PLB chuẩn bị mẫu cho tạo hạt nhân tạo

Nguồn mẫu khởi đầu cho quá trình nuôi cấy in vitro có thể được sử dụng là:

thân, lá, rễ, đỉnh sinh trưởng, chồi nách… Tuy nhiên, để việc nuôi cấy đạt hiệu quả cao và vì lan Hồ Điệp là loài thực vật đơn thân nên việc nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến cây mẹ, số lượng mẫu bị hạn chế. Việc nuôi cấy từ phát hoa có thể khắc phục được những hạn chế này.

Hình 2.1: Quy trình nhân giống lan Hồ Điệp bằng nuôi cấy phát hoa

2.1.1. Kỹ thuật phát sinh phôi soma Quá trình này gồm 2 giai đoạn:

2.1.1.1. Phát sinh và tăng sinh mô sẹo

Khái quát

Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để có thể hình thành nên cây hoàn chỉnh. Mô sẹo được hình

thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969).

Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy.

Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dưỡng (Street, 1969). Hildebrandt và csv, (1963) cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độ ánh sáng.

Để tạo mô sẹo, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung chất kích thích sinh trưởng, đôi khi là dịch chiết. Tùy thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất kích thích sinh trưởng thêm vào có thể khác nhau (Trần Văn Minh, 2003).

Phát sinh và tăng sinh mô sẹo

Nuôi cấy phát sinh mô sẹo

Có thể sử dụng nhiều nguồn mẫu khác nhau như: đỉnh sinh trưởng, chồi nách, lá, rễ… để làm nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu. Ở đây ta sử dụng phát hoa của cây.

Tách phát hoa làm nguồn mẫu khi cây bắt đầu nở hoa.

Cắt phát hoa thành đoạn nhỏ có chứa chồi ngủ.

Nuôi cấy các đoạn phát hoa này trên môi trường VW bổ sung 2,5 mg/l BA ở 20 - 28oC ta thu được các chồi nảy ra từ các chồi ngủ của phát hoa.

Lá non của chồi sinh dưỡng phát triển in vitro này được cắt thành các đoạn nhỏ và nuôi cấy để thu PLB.

Các PLB này được cắt nhỏ và cấy chuyền sang môi trường mới. Trên môi trường có bổ sung sucrose có rất nhiều mô sẹo được hình thành từ PLB. Trên môi trường có bổ sung nước dừa hoặc bổ sung kết hợp 2,4-D và BA ở tỉ lệ thích hợp thì mô sẹo tạo thành có kích thước rất lớn, có màu vàng xanh.

Tăng sinh mô sẹo

Môi trường nuôi cấy tăng sinh mô sẹo là môi trường giàu dinh dưỡng (có thể được bổ sung đường và nước dừa), các chất khoáng và cần được bổ sung chất kích thích sinh trưởng là auxin. Auxin giúp kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, tạo ra lượng lớn mô sẹo khi nuôi cấy.

Nguồn mẫu sử dụng nuôi cấy có thể là các mô sẹo sẵn có, các PLB.

Mô sẹo từ nuôi cấy trên được cấy chuyền sang môi trường có sucrose và bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin để tăng sinh mô sẹo.

Môi trường đặc cho kết quả tăng sinh mô sẹo tốt hơn.

Môi trường lỏng kết hợp lắc cho kết quả tăng sinh mô sẹo ít hơn môi trường đặc nhưng mô sẹo có kết cấu khá chắc và khi cảm biến tạo phôi thì lượng phôi được tạo ra nhiều hơn. Vậy mô sẹo được tăng sinh trong môi trường lỏng lắc thích hợp để cảm biến tạo phôi soma.

2.1.1.2. Phát sinh phôi soma

Môi trường nuôi cấy có rất ít hoặc không có auxin nhưng được bổ sung thêm vào đó là cytokinin, môi trường này cũng được hạn chế bớt các chất dinh dưỡng.

Với điều kiện các chất dinh dưỡng bị hạn chế và sự có mặt của cytokinin đã cảm ứng các mô sẹo hình thành phôi soma.

Cytokinin kích thích sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi.

Cytokinin còn có mối quan hệ tương tác với auxin, cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều.

Các mô sẹo được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường đặc ẵVW bổ sung 2 mg/l TDZ để cảm biến tạo phụi soma. Cỏc phụi này được sử dụng cho mục đích làm hạt nhân tạo hoặc nuôi cấy tiếp để phát triển thành cây hoàn chỉnh.

Mô sẹo nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc cho kết quả cảm biến tạo phôi tốt hơn so với mô sẹo nuôi cấy trên môi trường đặc.

2.1.2. Kỹ thuật phát sinh PLB

Môi trường nuôi cấy cần được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thuộc 2 nhóm cytokinin và auxin với tỉ lệ thích hợp để tạo ra số lượng PLB nhiều nhất.

Các auxin có vai trò tăng độ rộng và kéo dài tế bào thúc đẩy phân bào trong nuôi cấy (Krokorian, 1995) kích thích tế bào khử biệt hóa trở thành không phân hóa và có các đặc tính phân chia mạnh. Trong khi đó, với sự hiện diện đồng thời của cytokinin sẽ làm giảm hoạt tính phân chia mạnh ở các tế bào chịu tác động của auxin, dẫn đến các tế bào này tạo thành khối u và đó chính là tiền củ (Lê Văn Hướng, 2005).

PLB có đặc điểm phân chia rất mạnh mẽ nên chỉ cần nuôi cấy trên môi trường có các chất kích thích thích hợp thì chúng dễ dàng phát triển thành phôi, cơ quan hoặc cây con.

PLB có thể được tạo ra từ nhiều nguồn mô khác nhau. Nhiều quy trình nhân giống đã sử dụng các phần mô của cây con tạo ra từ phát hoa làm vật liệu nuôi cấy (Fu, 1979; Kushnir và Budak, 1980). Zimmer và cộng sự tiến hành nuôi cấy toàn bộ cây con từ chồi in vitro để thu nhận PLB, nghiên cứu được thực hiện tại trường đại học kỹ thuật Hannover (Đức) và thu được kết quả khả quan (Zimmer và Pieper, 1976, 1978, 1979).

Phát sinh PLB

Có thể sử dụng nhiều nguồn mẫu khác nhau như: đỉnh sinh trưởng, chồi nách, lá, rễ hoặc từ mô sẹo sẵn có… để làm nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu. Ở đây ta sử dụng phát hoa của cây.

Tách phát hoa làm nguồn mẫu khi cây bắt đầu nở hoa.

Cắt phát hoa thành đoạn nhỏ có chứa chồi ngủ.

Nuôi cấy các đoạn phát hoa này trên môi trường VW bổ sung 2,5 mg/l BA ở 20 - 28oC ta thu được các chồi nảy ra từ các chồi ngủ của phát hoa.

Lá non của chồi sinh dưỡng phát triển in vitro này được cắt thành các đoạn nhỏ và nuôi cấy để thu PLB.

Các mô sẹo cảm ứng từ PLB hay từ lá được nuôi trên môi trường VW có bổ sung nước dừa hay chất kích thích sinh trưởng để tái thu nhận PLB.

Mô sẹo được nuôi trên môi trường không có sucrose có bổ sung nước dừa hay sự kết hợp 2 chất kích thích sinh trưởng 2,4-D và BA ở tỉ lệ thích hợp thì mô sẹo chuyển sang màu xanh và tạo ra nhiều PLB.

Quan sát mô không thấy có sự liên kết mạch giữa mỗi PLB và các mô khác.

Như vậy PLB có nguồn gốc từ mô sẹo có thể được xem như phôi vô tính.

Ghi chú: Các môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) ; VW (Vacin và Went, 1949).

Bảng 2.1: Thành phần khoáng cơ bản của môi trường MS

Bảng 2.2: Thành phần khoáng cơ bản của môi trường VW

Một phần của tài liệu Tổng quan về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nhân tạo lan hồ điệp phalaenopsis sp (Trang 33 - 38)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(60 trang)