Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A. subresinosum
❖ Nguyên tắc
Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là tách các hợp chất hữu cơ thành các nhóm khác nhau dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất này trong các dung
22
môi hữu cơ có tính phân cực khác nhau, sau đó mỗi nhóm được phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng.
❖ Phương pháp chiết [11]
Dietyl eter
Ethanol
Nước 70oC/cách thủy
Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc
➢ Chiết với dietyl eter
Trong một erlen 100 ml, cho vào 5g mẫu khô và 30ml dietyl eter, khuấy trộn đều trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lọc ngang qua giấy lọc. Lặp lại sự chiết với dietyl eter vài lần cho đến khi dung dịch chiết cuối nhạt màu.
Cho dịch chiết dietyl eter vào bình lóng, chiết 3 × 20 ml dung dịch nước KOH 10%: trong bình lóng có hai lớp là lớp nước kiềm và lớp dietyl eter.
Lấy lớp nước kiềm: cho vào becher, trung hòa bằng dung dịch HCl 25% cho đến khi trung tính. Lọc bằng phễu để lấy tủa. Hòa tủa này vào 5ml ethanol 90o và chia dung dịch này vào đều trong 3 ống nghiệm
▪ Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10%, nếu thấy có màu đỏ, có thể có antraglycosid.
Mẫu khô
Bã
Dịch chiết nước Dịch chiết cồn Dịch chiết Eter
Bã
Bã
23
▪ Ống 2: Acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một vài hột Mg kim loại, nếu thấy có màu đỏ, có thể có flavonoid.
▪ Ống 3: Nhỏ một vài giọt dung dịch lên tờ giấy lọc, nếu thấy trên tờ giấy lọc có vết mờ, có thể có acid béo.
Lấy lớp dietyl eter: cho vào bình lóng, rửa dung dịch eter này với nước cất (3 x 20 ml), tiếp theo chiết với dung dịch H2SO4 2% (3 x 5 ml) sẽ có hai lớp: lớp etyl eter và lớp nước của acid.
▪ Lớp nước acid được gom chung lại, định tính với các thuốc thử alkaloid.
Thuốc thử Mayer cho tủa màu vàng nhạt; thuốc thử Bouchardat cho tủa màu nâu;
▪ Lớp ethyl eter được chia đều vào ba chén sứ và cho bốc hơi đến khô:
* Chén 1: nếu có mùi thơm có thể có tinh dầu.
* Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu có màu xanh có thể có carotenoid.
* Chén 3: Sử dụng thuốc thử Lieberman (Ac2O/H2SO4): nhỏ 10 giọt anhidrid acetic vào chén để hòa tan cắn, rồi rót hết dung dịch này vào một ống nghiệm. Nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu thấy mặt phân cách giữa hai dung dịch trong ống nghiệm có màu vàng lục hoặc lục đỏ, có thể có phytosterol (steroid thực vật).
➢ Chiết với ethanol 90o
Bã cao sau khi chiết với ethyl eter được chiết với ethenol (3 x 30ml). Sau mỗi lần chiết, lọc qua ngang qua một tờ giấy lọc, gộp ba lần chiết lại để có dung dịch alcol.
Dung dịch được chia làm 6 phần, mỗi phần khoảng 15 ml dung dịch.
Phần 1: Pha loãng dung dịch alcol với 4 lần thể tích nước cất. Kiềm hóa bằng dung dịch NH4OH đậm đặc, sẽ có tủa. Lọc để có phần tủa và phần dung dịch qua lọc.
• Phần tủa được hòa với 1 ml chloroform, cho vào ống nghiệm. Thêm vào thuốc thử Lieberman gồm 1 ml anhidrid acetic và nhỏ chầm chậm vào dọc
24
theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch có màu xanh dương lục, có thể có steroid.
• Phần dịch lọc được acid hóa bằng HCl, sẽ có tủa. Lọc lấy tủa và hòa tủa với 3 – 4 ml etanol 90o và chia đều vào hai ống nghiệm
* Ống 1: cho và giọt KOH 10%, nếu có màu đỏ, có thể có antraglycosid.
* Ống 2: cho vào một ít bột Mg kim loại và vài giọt HCl đậm đặc, nếu có màu đỏ, có thể có flavonoid.
Phần 2: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào hay ống nghiệm.
* Ống 1: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có màu xanh đen, có thể có tanin.
* Ống 2: Cho vào vài tinh thể Na2CO3, nếu có sủi bọt, có thể có acid hữu cơ.
Phần 3: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn. Hòa cặn này với 3 – 4 ml H2SO4 2%. Dung dịch này được thử với 2 loại thuốc thử alkaloid: Mayer, Bouchardat.
Nếu dương tính với tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid.
Phần 4: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn. Hòa cặn này với 3 – 4 ml nước cất, đun nóng và lọc. Cho vào dung dịch lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử.
Phần 5: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: acid hóa, nếu có màu đỏ. Ống 2: kiềm hóa nếu có màu lục. Nếu cả hai ống nghiệm đều có màu như nêu trên, có thể có antocyanosid.
Phần 6: Chia dung dịch alcol đều vào 2 ống nghiệm và cho bốc hơi đến cạn.
* Ống 1: Cho vào 5 ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin.
* Ống 2: Cho vào 0,5 ml chloroform và 0,5 ml anhidrid acetic. Nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu ở mặt phân
25
cách xuất hiện màu tím, có thể có saponin triterpen; nếu có mặt phân cách xuất hiện màu xanh dương lục, có thể có saponin steroid.
➢ Chiết với dung dịch nước H2SO4 1%
Phần bả còn lại được chiết với dung dịch nước H2SO4 1% (3 x 20 ml). Lọc và chia dịch chiết vào 5 ống nghiệm.
Phần 1: Lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin.
Phần 2: Kiềm hóa với dung dịch NH4OH 10%, chiết với diethyl eter (3 x 5 ml).
Lóng lấy lớp dietyl eter. Lại chiết lớp dietyl eter này với dung dịch H2SO4 1%. Lóng lấy lớp nước, để định tính với 2 loại thuốc thử Mayer, Bouchardat. Nếu dương tính với tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid.
Phần 3: Cho vào dung dịh lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử.
Phần 4: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có màu xanh đen, có thể có tanin.
Phần 5: Pha loãng với 2 lần thể tích etanol cao độ, nếu có tủa nhiều, có thể có hợp chất đường loại acid uronic.