2.3 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
2.3.2 Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong quá trình phát hiện loài
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2008)[15].
2.3.2.2 Gen rDNA
Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được
thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật.
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA .
Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi.
Primer
Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5.8S và 28S.
ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S.
cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S. prombe, S. cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25bp.
Bảng 2.5 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene) ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG
G
1773-1791 (18S)
White et al. 1990 ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA
GTA A
1735-1756 (18S)
Gardes & Bruns 1993
ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC
53-34 White et al. 1990 ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA
GC
34-53 White et al. 1990 ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT
GC
57-38 (25S) White et al. 1990 ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG
TCC AG
194-172 (25S) Gardes & Bruns 1993
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G
1749-1770 (18S)
White et al. 1990
5.8SR TCG ATG AAG AAC GCA GCG 37-54 Vilgalys lab
Hình 2.4 Bảng đồ primer ITS
Chỉ định dùng cho PCR: ITS1 hoặc ITS5, ITS1-F và ITS4 hoặc LR15, ITS4-B 2.3.2.3 Ứng dụng của PCR trong quá trình phát hiện loài vi sinh vật
Kỹ thuật PCR ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA, phát hiện vi khuẩn hay vi-rút ở nồng độ thấp trong các mẫu môi trường và bệnh phẩm, tách dòng gen, và xác định huyết thống. Từ khi có sự ra đời của kỹ thuật PCR thì kỹ thuật giải trình tự cũng có những tiến bộ vượt bậc.[15]
Kỹ thuật PCR đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu xác định DNA nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn DNA đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hoặc vi-rút hoặc trong trường hợp khác là cần thời gian nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho việc lai hoặc xác định loài. PCR ra đời đã khắc phục được những khó khăn này [15].
Tiến hành PCR khuếch đại những đoạn gen đặc trưng của các loài vi sinh vật nghiên cứu dựa trên những cặp mồi đặc trưng của từng loài vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có những cặp mồi chuyên biệt để có thể dựa vào đó chúng ta có thể dễ dàng xác định được chúng. Đối với việc định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn thì việc thiết kế mồi dựa trên đoạn gen 16S-rDNA luôn là
lựa chọn ưu tiên của các nhà khoa học. Daniela (2009) sử dụng cặp mồi 27F và 1495R để khảo sát vùng 16S-rDNA của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ nho. Lucia (2004) cũng sử dụng cặp mồi này khảo sát vùng 16S-rDNA của họ vi khuẩn Azotobacteraceae gồm 7 loài thuộc chi Azotobacter và 3 loài thuộc chi Azomonas.[15]
Lu (2000) đã sử dụng PCR với một cặp mồi, U1 (5’- CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’) và U2 (5’- ATC GG(C/T) TAC CTT GTT CAG ACT TC-3’) có khả năng khuếch đại một phần của gen 16S rRNA của eubacteria. Edmilson và ctv (2002), sử dụng trình tự mồi Xan1330 (5’-GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC-3’) được thiết kế trên vùng 16S - 23S xác định Xanthomonas sp. [15]