2.1.
Địa điểm nghiên cứu 2.1.1.
Địa điểm thu mẫu: Huyện Củ Chi- Thành phố Hồ Chí Minh.
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM.
Thời gian nghiên cứu 2.1.2.
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 30/04/2017 đến tháng 16/07/2017 Vật liệu nghiên cứu
2.2.
Nguồn mẫu 2.2.1.
Lá cây Lá đắng đƣợc lấy từ Huyện Củ Chi- Thành phố Hồ Chí Minh thời gian hái lá từ 9h đến 11h giờ sáng cho vào túi nilong vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành các thí nghiệm.
Hình 2.1. Hình ảnh cây Lá đắng Vi sinh vật chỉ thị
2.2.2.
Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 5 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Viện sinh Học Nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh, bao gồm:
- Vi khuẩn Salmonella - Vi khuẩn E. Coli
- Vi khuẩn Staphylococcus arueus
39 - Vi khuẩn Bacillus Cereus
- Vi khuẩn Listeria monocytogenes Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.3.
2.2.3.1. Hóa chất – môi trường
- Môi trường NB (Nutrient Broth) (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trường NA (Nutrient Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trường EMB (Eosin Methylene Blue Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) (HiMedia - Ấn Độ).
- DMSO (dimethylsulfoxid) (Trung Quốc)
- Ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 90% (Việt Nam) 2.2.3.2. Dụng cụ thí nghiệm
- Đĩa petri - Ống nghiệm - Pipet 1ml, 10ml
- Micropipette 100ml, 100ml
- Bình chứ môi trường 250ml, 500ml - Cốc 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml - Đầu tuýp 100àl, 1000àl
- Que cấy vòng, que trang, que gắp - Đèn cồn
- Thước đo
- Bông gòn thấm và không thấm - Đũa thủy tinh
- Ống đục lỗ đường kính 6mm 2.2.3.3. Thiết bị
- Tủ cấy vi sinh (Brlad France) - Tủ ủ (Memmert Germany) - Tủ lạnh Toshiba
- Autolave (Huxky Đài Loan)
40 - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Bếp từ (Billy – England)
- Máy nước cất (Branstead USA) Phương pháp nghiên cứu 2.3.
Phương pháp xử lí nguồn mẫu 2.3.1.
Lá cây sau khi thu hái về được rữa sạch bằng nước máy, để ráo trong bóng râm rồi giã nhỏ để ngâm mẫu tiến hành các thí nghiệm.
Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.2.
Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh nhƣ glycerol.
Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
Phương pháp pha loãng mẫu 2.3.3.
Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu.
Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha
41
loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành nhƣ vậy cho đến khi đƣợc nồng độ cần thiết.
Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013).
Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị 2.3.4.
Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn đang đƣợc bảo quản phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dƣỡng (đa lƣợng và vi lƣợng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường.
Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị đƣợc giữ trên môi trường NB hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường NB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013).
Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật 2.3.5.
Mẫu thực vật được tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng phương pháp chiết ngâm ở nhiệt độ thường và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lƣợng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp.
Nguyên tắc phương pháp chiết ngâm: mẫu thực vật được ngâm trong dung môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3
42
giai đoạn: thâm nhập dung môi vào mẫu, hoà tan các chất trong mẫu, khuếch tán các chất tan.
Mục đích: Thu hồi cao chiết thực vật ở dạng cao đặc với độ ẩm < 20% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành: Mẫu đã xử lí cân và ngâm với dung môi thích hợp trong vòng 24 giờ, sau đó lọc lấy dịch lọc. Tiến hành cô cách thủy ở 700C dịch lọc tới khô thu được cao chiết. Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cách khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi) (Nguyễn Thƣợng Đông và Đặng Quang Chung, 2008).
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết thực vật 2.3.6.
Mục đích: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch hay còn gọi là phương pháp khuếch tán giếng thạch.
Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế vi khuẩn thì xuất hiện vòng ức chế xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng ức chế (mm).
Cách thực hiện: Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa với mật độ thích hợp cho vào môi trường NA (hoặc các môi trường thích hợp với từng vi khuẩn) và tiến hành trang đều đến khô. Sau đó dùng ống đục lỗ có đường kính 6mm tạo các giếng trên mặt đĩa thạch, hút dịch cao chiết thực vật vào giếng, ngay tại giếng các chất kháng khuẩn trong dịch cao chiết thực vật khuếch tán vào môi trường thạch và đối kháng với vi sinh vật chỉ thị, ngăn cản hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật chỉ thị xung quanh giếng (Aibinu và ctv, 2007).
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 2.3.7.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường lỏng (broth dilution method)
43
Nguyên tắc: dựa trên sự thay đổi độ dục của dung dịch chƣa dịch cao chiết và dịch vi khuẩn. Quan sát độ đục kết luận nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp nhất mà tại đó ống nghiệm không bị đục.
Phương pháp xử lí số liệu 2.3.8.
Các số liệu thực nghiệm được xử lí thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsofl Excel. Kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá, so sánh giá trị trung bình giữa các lô thí nghiệm bằng phương pháp thống kê trong Statgraphic Centurion XV veusion 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey.
Bố trí thí nghiệm 2.4.
Tiến trình thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây lá đắng đƣợc trình bày ở hình 2.1:
44
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Mẫu cây
Xử lí mẫu
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao tổng
Xác định MIC Cao tổng từ các loại dung môi khác nhau Tách chiết cao chiết từ các dung môi khác nhau
Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết
45
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu 2.4.1.
suất thu hồi cao từ cây lá đắng.
Hình 2.4. Mẫu ngâm trong dung môi Mẫu cây
Xử lí mẫu
Ngâm dung môi
Tỉ lệ 1/3(w/v) trong 24 giờ
Dung môi
Nước Ethanol 500
Ethanol 700
Ethanol 900
Lọc tinh
Bảo quản lạnh 40 C
Cô cách thủy (700 C) Dịch lọc
Cao thuốc
46
Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt 2.4.2.
tính kháng khuẩn của cao chiết từ cây lá đắng.
Hình 2.4. Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Đầu tiên đối với vi sinh vật chỉ thị tiến hành quy trình tăng sinh. Sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối của các chủng vi sinh vật chỉ thị từ các ependoff giữ giống sang các erlen chứa 10 ml môi trường NB sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành đo OD dịch tăng sinh ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn và dịch vi khuẩn đƣợc pha loãng để đạt mật độ 106 cfu/ml.
Hỳt 100 àl dịch đó pha loóng cho vào đĩa NA, EMB, XLD trang đều đĩa cho đến khi dịch khô, dùng ống trụ kim loại có đường kính 6 mm tiến hành đục 3 lỗ trên đĩa.
Ủ 370C/24 giờ Vi sinh vật chỉ thị
Tăng sinh trong môi trường NB
Đo OD600nm
Pha loãng về 106 cfu/ml
Đỗ đĩa
Đục lỗ (d = 6mm) Môi trường NA,
XLD,EMB
Đọc kết quả
Cao chiết
Dịch cao chiết +DMSO 10%
Cấy trang
Nhỏ dịch
47
Đối với cao chiết cần khảo sát tiến hành pha trong DMSO 10% để đạt nồng độ 1 g/ml. Sử dụng micropipette hút dịch cao chiết cho vào các lỗ đã đƣợc đục trên
đĩa, tiến hành ủ ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vòng kháng khuẩn có trên đĩa.
Thí nghiệm 3: xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 2.4.3.
Hình 2.6. Sơ đồ xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Đầu tiên tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị bằng cách sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối sau đó cấy vào erlen chứa 10 ml môi trường NB, đem lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành đo OD dịch tăng sinh ở bước
Vi sinh vật chỉ thị
Tăng sinh trong môi trường NB
Đo OD600nm
Pha loãng về 106 cfu/ml
Môi trường NB
Ủ 370C/24 giờ Ống nghiệm vô trùng
Cao chiết
Pha loãng nhiều nồng độ
theo cấp số 2 +DMSO 10%
Quan sát độ đục
Xác định MIC
48
sóng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn và sau đó pha loãng về mật độ 106 cfu/ml.
Cao chiết ethanol 50% đƣợc hòa tan với DMSO 10% thành dãy nồng độ theo cơ số 2 từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml. Hút a ml cao chiết từ các dãy nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm có chứa sẵn môi trường NB. Dịch cao chiết bổ sung vào ống nghiệm với tỷ lệ 1:3 (v/v). Sau đó hút dịch vi khuẩn đã đƣợc pha loãng cho vào ống nghiệm. Đối với đối chứng dương chỉ có dịch cao chiết và môi trường dinh dưỡng không chứa vi sinh vật chỉ thị, đối chứng âm chứa môi trường dinh dưỡng và vi sinh vật chỉ thị không chứa cao chiết. Tất cả ống nghiệm đƣợc đem ủ ở 370C trong 24 giờ.
Tiến hành đọc kết quả bằng cách so độ đục của các ống nghiệm thử nghiệm với đối chứng dương.
49
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN