CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Các phương pháp phân tích
2.5.1. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp DNS
Nguyên tắc : dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS.
DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử tạo màu đỏ cam khi đun nóng với hỗn hợp phản ứng.
Cường độ màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử được đo bằng máy đo quang phổ với bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng đường trong mẫu.
Tiến hành :
- Hút 1ml dịch mẫu và 1ml nước cất vào ống nghiệm để làm mẫu không.
- Thêm 3ml thuốc thử DNS.
- Đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy 15 phút.
- Làm nguội nhanh, đo ở bước song 540nm.
- Dựa vào đường chuẩn để tính ra nồng độ đường trong mẫu.
2.5.2. Phương pháp xác định lượng cellulose bằng thuốc thử Anthrone
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng tạo màu giữa Anthrone với cellulose có trong dịch mẫu tạo màu xanh lá đến xanh đen phụ thuộc vào nồng độ cellulose trong mẫu.
Tiến hành:
- Hút 0,5 ml dịch mẫu và 0,5 ml nước cất vào ống nghiệm để làm mẫu không.
- Thêm 5ml dd Anthrone vào ống nghiệm.
- Đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy 5 phút.
- làm nguội, đo ở bước sóng 630nm.
- Dựa vào đường chuẩn để tính được nồng độ cellulose có trong mẫu.
2.5.3. Xác định pH, độ rượu và tổng số chất khô hòa tan
43
- Dùng pH kế xác định độ pH.
- Dùng Brix kế xác định nồng độ chất rắn hòa tan.
- Dùng cồn kế xác định độ cồn.
2.5.4. Phương pháp nuôi cấy nấm men
Chuẩn bị môi trường SDA có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại.
Tiến hành cấy giống nấm men từ ống giống gốc sang ống môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn từ trước (môi trường SDA có bổ sung thạch với hàm lượng 2%). Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này.
Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân giống qua hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: sau khi nấm men đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng, cấy sinh khối vào erlen chứa 20ml dịch môi trường SDB đã được hấp tiệt trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường (28 – 30 oC) trong 24 giờ.
Hình 2.3. Khuẩn lạc trên môi trường SDA
44
Hình 2.4. Khuẩn lạc trên môi trường thạch nghiêng SDA
Giai đoạn 2: lấy 10 ml dịch môi trường SDA cho vào erlen 250ml, hấp tiệt trùng, để nguội, cho toàn bộ nấm men trong erlen đã nuôi giống (giai đoạn 1) vào erlen và nuôi ở điều kiện 30 oC, 24 giờ.
Hình 2.5. Nhân giống cấp 1 trong môi trường SDB
Giống nấm men sau khi nhân giống đạt đủ sinh khối sẽ được dùng trong lên men bioethanol. Trước khi giống này được sử dụng cho đợt lên men sau thì cần
45
hoạt hóa trước 8 – 24 giờ trong môi trường mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực trở lại.
Hình 2.6. Nhân giống cấp 2 trong môi trường SDB 2.5.5. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc: xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch , xác định số tế bào sống để phục vụ cho quá trình lên men cũng nhu xác định số tế bào còn lại sau quá trình lên men.
Tiến hành:
- Pha loãng mẫu: chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml dd nước muối sinh lý và micropipette đã hấp khử trùng , tiến hành pha loãng mẫu ở các hệ số pha loãng như : 10-1, 10-2, 10-3,10-4,… chọn 3 nồng độ pha loãng thích hợp.
- Cấy mẫu: Dùng 0,1 micropipet hút 0,1ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa thạch, sử dụng que cấy trang để trang đều các tế bào lên bề mặt đĩa thạch. Tiến hành trên các độ pha loãng khác nhau sẽ cấy trang lên các đĩa thạch .
- Đặt các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong thời gian 48 giờ.
- Tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 1ml dd mẫu.
- Mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch mẫu theo số liệu đã tiến hành trên thí nghiệm pha loãng được tính theo công thức:
A(cfu/ml) = B x C/V
46
B: số khuẩn lạc trung bình mỗi đĩa ở 1 độ pha loãng.
C: Độ pha loãng.
V: dung tích huyền phù ở mỗi đĩa (0,1ml)
47