4.6. Nghiên cứu phương pháp tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh
4.6.1. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh cây lan hoàng thảo Vôi Đỏ từ
Nồng độ Kinetin
(mg/l) Dạng pro (%) Dạng chồi (%)
6-BA (2mg/l)+
Kinetin
0,0 15,2 5,2
0,1 30,2 6,0
0,2 30,4 15,2
0,3 29,6 7,8
0,4 0,5
30,3 28,8
0,0 0,0
Theo dõi tỷ lệ tạo protocorm và chồi của mẫu sinh trưởng trên môi trường bổ sung kinetin, 6-BA cho thấy tại nồng độ kinetin hoặc 6-BA thấp khả năng bật chồi tốt hơn, còn nồng độ 6-BA hoặc kinetin cao khả năng tạo protocorm tốt hơn.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy các mẫu này trên môi trường bổ sung kết hợp 6-BA và kinetin ở nồng độ thích hợp đã có hiệu quả cao hơn hẳn so với nuôi cây trên môi trường đơn lẻ, kết quả thấy rằng môi trường 6-BA 2mg/l kết hợp với kinetin 0,1 - 0,5mg/l đều cho kết quả tốt, cao nhất ở môi trường 6-BA 2mg/l + kinetin 0,2mg/l có tỉ lệ mẫu phát sinh hình thái đạt 45,6%, trong đó dạng protocorm 30,4% và dạng chồi 15,2%.
Như vậy nồng độ Kinetin là 0,2mg/l được chọn là nồng độ thích hợp để nhân protocorm.
4.6. NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁI SINH CÂY VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH
4.6.1. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh cây lan hoàng thảo Vôi Đỏ từ protocorm
4.6.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tái sinh và nhân chồi Ở thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân nhanh sinh khối protocorm mẫu lan đưa vào nuôi cấy, đã xác định được môi trường VW là phù hợp nhất.
Chúng tôi đã tiếp tục tiến hành thí nghiệm bổ sung 6-BA – một chất kích thích
khả năng tái sinh hình thành cây với các nồng độ khác nhau vào môi trường VW.
Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tái sinh và nhân chồi từ protocorm (sau 6 tuần)
Công thức
Nồng độ 6-BA (mg/l)
Số pro ban đầu
Số chồi
thu được
Hệ số nhân
chồi (lần) Chất lượng chồi B0
B1 B2 B3 B4 B5
0,00 100 5,14 1,05 Có hiện tượng vàng úa
0,25 100 10,02 1,89 Xanh, tốt
0,50 100 16,67 1,46 Xanh, tốt
0,75 100 11,75 2,13 Xanh, tốt
1,00 100 10,50 2,82 Xanh, tốt
1,25 100 10,67 3,11 Có hiện tượng vàng úa
CV(%) 1,2
LSD(%) 0,62
Hình 4.6. Ảnh hưởng của 6-BA lên khả năng tạo chồi từ protocorm sau 6 tuần nuôi cấy
Qua kết quả nghiên cứu và quan sát thí nghiệm cho thấy khi 6-BA bổ sung vào môi trường có ảnh hưởng tốt đến khả năng tái sinh chồi của các giống hoàng thảo. Đặc biệt tại nồng độ 6-BA 0,5mg/l đạt hệ số nhân protocorm và chồi chỉ đạt 1,46 lần nhưng số chồi thu được đạt cao nhất so với các công thức bổ sung 6- BA khác đạt 16,67 chồi/100 protocorm ban đầu, chất lượng chồi xanh tốt. Các công thức khác như B5 cho hệ số nhân là cao nhất, tuy nhiên số lượng chồi chỉ đạt 10,67 chồi và chất lượng chồi kém.
Kết quả cho thấy tăng nồng độ 6-BA lên thì xu hướng tạo protocorm cũng tăng lên đáng kể phù hợp với nhân tạo sinh khối protocorm. Tuy nhiên để thể tiền chồi phát triển thành thể chồi và chất lượng chồi tốt thì thích hợp trong khoảng 0,25-1mg/l. Nếu tăng nồng độ 6-BA lên thì xu hướng chồi phát sinh có hiện tượng vàng úa và chết.
B2
B5 B4 B3 B1 B0
Như vậy, có thể bổ sung vào môi trường cơ bản 6-BA 0,5mg/l để tái sinh chồi từ protocorm.
4.6.1.2. Ảnh hưởng của 6-BA kết hợp vơi Kinetin tới khả năng tái sinh cây và nhân chồi từ protocorm
6-BA, Kinetin thuộc nhóm cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân tế bào, kéo dài sự sinh trưởng của mô. Một số tác giả trên thế giới cũng bổ sung kinetin vào môi trường tái sinh cây và đạt kết quả tốt. Vì vậy, thí nghiệm bổ sung thêm vào môi trường tái sinh cây kinetin ở nồng độ thấp.
Bảng 4.10. Ảnh hưởngcủa 6-BA kết hợp với kinetin đến khả năng tái sinh và nhân chồi từ protocorm (sau 6 tuần)
Nồng độ 6-
BA (mg/l)
Nồng độ kinetin
(mg/l)
Số pro ban đầu
Số pro thu được
Số chồi
thu được
Hệ số nhân
chồi (lần) Chất lượng chồi
0,5
0,0 100 95 30 1,25 Xanh, hơi ngắn
0,1 100 231 47 2,78 Xanh đậm, chồi dài
0,2 100 366 54 4,20 Xanh nhạt, chồi ngắn
0,3 100 217 45 2,62 Xanh nhạt, chồi ngắn
0,4 100 207 36 2,43 Chồi hơi vàng và dài
0,5 100 174 31 2,05 Chồi vàng
CV(%) 0,4
LSD(%) 1,22
Hình 4.7. Ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng tạo chồi từ protocorm sau 6 tuần nuôi cấy(ki=kinetin)
Kết quả nghiên cứu thấy rõ khi bổ sung kinetin vào môi trường tái sinh đã tăng đáng kể tỉ lệ tái sinh chồi. Mẫu cấy vào môi trường có bổ sung 0,5mg/l 6- BA và kinetin từ 0,0 - 0,5mg/l đã tăng sinh khối từ 1,25 lần đến 4,2 lần so với
Ki4 Ki1 Ki3 Ki0 Ki2 Ki5
mẫu ban đầu, trong đó môi trường bổ sung 6-BA 0,5mg/l kết hợp với kinetin 0,2mg/l có tỉ lệ bật chồi cao đạt 54 chồi đạt kết quả tốt nhất, nếu tiếp tục tăng nồng độ kinetin thì tỉ lệ bật chồi và chất lượng chồi giảm.
Như vậy, nồng độ kinetin là 0,2mg/l thích hợp để bổ sung vào môi trường tái sinh cây.
4.6.1.3. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi
Sau khi nhân chồi với số lượng lớn, thí nghiệm tách chồi và cấy trên môi trường kéo dài chồi là môi trường VW bổ sung GA3 nồng độ từ (0-1)mg/l + 30g/l đường + 5,5g/l Agar, pH 5,8 Kết quả theo dõi và xác định sau 4 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 4.11.
Bảng 4.11. Ảnh hưởng kết hợp GA3 đến quá trình kéo dài chồi Công
thức
Nồng độ GA3(mg/l)
Sau 4 tuần nuôi cấy Chiều cao
cây (cm)
Số lá/
cây Đặc điểm cây
CT1 0,0 0,91 2,2 Lá xanh, cây cứng
CT2 0,1 1,80 2,5 Lá xanh, cây cứng
CT3 0,2 2,50 3,3 Lá xanh bong, cây cứng cáp
CT4 0.3 2,78 3,1 Lá xanh nhạt, cây yếu
CT5 0,4 3,74 2,7 Lá xanh nhạt, cây yếu
CT6 0,5 4,20 2,6 Lá xanh vàng, một số lá xoăn, cây hơi yếu
CT7 1,0 4,83 3,2 Một số lá xanh sọc trắng, cây gầy yếu
CV%
LSD5%
1,5 0,42
2,5 0,57
Kết quả cho thấy khi bổ sung GA3 nồng độ từ 0,1-0,2mg/l sự tăng trưởng chiều cao cây đồng biến với tăng trưởng số lá/cây, khi đó chiều cao đạt 2,5cm và số lá đạt 3,3 lá và lá xanh cây bóng cứng cáp, tuy nhiên nếu tiếp tục tăng GA3
nồng độ lớn hơn hoặc bằng 0,4mg/l thì sự tăng trưởng chiều cao cây nghịch biến với tăng trưởng số lá/cây. Tại công thức có nồng độ GA3 cao > 0,8mg/l GA3 kết hợp với 6-BA xuất hiện lá nhỏ xoăn, có những gạch trắng xuất hiện giữa lá xanh, lá và cây lả. Khi bổ sung GA3 nồng độ 0,1 - 0,2 mg/l thì khả năng sinh lá cũng biến thiên theo một quy luật tăng số lá, những lá này mở rộng, màu xanh thẫm.
Nguyên nhân của phản ứng này có thể do mối tương quan giữa dư lượng 6-BA, kinetin còn trong cây và GA3 trong thí nghiệm.
Như vậy, bổ sung vào môi trường 0,2mg/l GA3 là thích hợp nhất để kéo dài chồi, khi đó cây mập, khỏe, xanh và có chiều cao 2,5 cm, 3,3 lá/cây sau 4 tuần nuôi cấy.
4.6.1.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ
Cây sinh trưởng trong điều kiện không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng vẫn ra rễ và rễ thường chỉ có 1chiếc, khá dài. Các rễ này khi đưa ra ngoài tự nhiên thường bị chết. Nguyên nhân có thể do bộ dễ ít, mảnh, yếu khiến chúng chưa thích nghi được với môi trường bên ngoài. Do đó, đồng thời với việc kéo dài chồi kết hợp tạo cây hoàn chỉnh bằng cách bổ sung vào môi trường kéo dài chồi 0,2mg/l GA3 + (0 - 1,0 mg/l) α-NAA. Kết quả sau 6 tuần theo dõi thu được trình bày ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ của cây
CT Nồng độ α-NAA
(mg/l) Số rễ/ cây Chiều dài rễ (cm)
Tỷ lệ ra rễ (%)
R0 0,0 1,3 0,2 37,3
R1 0,2 2,3 1,5 45,1
R2 0,4 2,7 2,9 58,6
R3 0,6 5,3 2,7 82,2
R4 0,8 4,6 2,5 51,1
R5 1,0 3,1 1,8 35,6
CV%
LSD5%
1,7 0,52
0,9 1,26
Hình 4.8. Ảnh hưởng của α - NAA lên khả năng tạo rễ sau 6 tuần nuôi cấy
R0 R4 R2 R3 R1 R5
Sự hình thành rễ trong đó có tỉ lệ ra rễ, số rễ/cây đều diễn ra theo một quy luật tăng dần và đạt cao nhất tại công thức công thức R3 sau đó giảm dần. Cụ thể là trên môi trường không bổ sung α-NAA công thức 1 tỷ lệ cây ra rễ đạt thấp nhất 37,3%, chỉ đạt 1,3 rễ/cây và độ dài rễ 0,2cm. Trên môi trường có bổ sung α- NAA tỷ lệ cây ra rễ tăng dần từ công thức công thức R1 đạt 45,1% đến công thức công thức R3 đạt 82,2% sau đó giảm dần từ công thức công thức R4, số rễ/cây cũng tăng theo quy luật này đạt cao nhất 5,3 rễ/cây ở công thức công thức R3.
Độ dài của rễ tăng theo nồng độ của α-NAA từ 0 - 0,6mg/l sau đó giảm dần, rễ màu trắng ở tất cả các công thức. Ngoài ra, bổ sung 0,2mg/l GA3 kết hợp với α- NAA (0 - 0,6)mg/l kích thích tăng chiều cao, tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ α-NAA thì ức chế chiều cao cây.
Như vậy: Nồng độ α-NAA thích hợp cho sự hình thành rễ cây là 0,6mg/l.
Các cây này chuyển sang môi trường nuôi cây sau đó ra cây ngoài vườn đều sinh trưởng tốt.
4.6.1.5 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến quá trình sinh trưởng của cây con in vitro
Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek và cs, 1941,1942). Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận (Vũ Văn Vụ, 1997). Nước dừa đã được nhiều tác giả xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và các chất kích thích sinh trưởng.
Để xác định vai trò của nước dừa đối với sự sinh trưởng của cây con in vitro, chúng tôi đã sử dụng môi trường thích hợp nhất cho cây con phát triển với hàm lượng 6-BA, Kinetin và α-NAA đã được xác định là (6-BA = 0,5 mg/l, Kinetin
= 0,2 mg/l và NAA = 0,6 mg/l) với các nồng độ nước dừa thay đổi từ 0% đến 5%, 10% và 20%.
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến quá trình sinh trưởng của cây con in vitro (sau 3 tháng nuôi cấy)
CT
Nồng độ nước dừa
(ml/l)
Số lá/cây
Chiều dài lá (cm)
Chiều rộng lá
(cm)
Số rễ/cây
Chiều dài rễ (cm)
CT1 0 3,8 0,81 0,54 2,1 2,58
CT2 50 4,2 1,23 0,62 3,4 2,76
CT3 100 7,6 1,57 0,60 5,6 4,65
CT4 200 7,3 1,42 0,57 3,0 3,34
CV(%) 3,4 0,6 1,3 2,8 0,70
LSD (%) 2,53 0,46 0,23 2,04 0,77
Hình 4.9. Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa tới sinh trưởng của cây con in vitro
Kết quả cây sinh trưởng sau 3 tháng cho thấy: việc bổ sung nước dừa với nồng độ thích hợp vào môi trường nuôi cấy đã ảnh hưởng rất lớn đến quá trình nhân chồi và chất lượng chồi, nuôi cấy trên môi trường có bổ sung nước dừa cho chồi xanh đậm và khoẻ cây hơn, nhìn chung cây sinh trưởng tốt trên môi trường bổ sung 100ml nước dừa/l môi trường. Phân tích sự biến thiên sinh trưởng ở các công thức cho thấy: trên môi trường không bổ sung nước dừa cây sinh trưởng kém hơn so với có bổ sung, sự sinh trưởng này tăng dần lên khi bổ sung vào 50ml nước dừa/l môi trường, đạt sinh trưởng tốt nhất khi bổ sung 100ml nước dừa/l môi trường. Khi đó, trung bình mỗi cây có 7,6 lá, chiều dài lá đạt 1,57cm, chiều rộng lá đạt 0,6cm và số rễ trung bình là 5,6 và chiều dài rễ là 4,65cm. Nếu bổ sung vào
CT1 CT2 CT3 CT4
môi trường quá nhiều nước dừa cũng ảnh hưởng không tốt tới sự sinh trưởng của cây khi đó cây xanh mướt, lả khi đưa ra ngoài vườn ươm dễ bị chết.