4.3. CHẨN ĐOÁN GÀ MẮC BỆNH ORT
4.3.2. Chẩn đoán vi khuẩn học
Sau khi quan sát các triệu chứng lâm sàng, tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm nuôi cấy trên môi trường thạch máu Colombia Blood Agar (có bổ sung 5% mỏu thỏ và 10àl/ml Gentamycin), ở điều kiện 37ºC, CO2 5%, trong thời gian 48 - 72h để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn ORT trong cơ thể gà nghi mắc bệnh. Kết quả nuôi cấy được hiển thị ở hình 4.14.
Hình 4.14. Khuẩn lạc ORT nuôi cấy trên môi trường thạch máu sau 48 giờ
Quan sát và chọn những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.13: khuẩn lạc nhỏ, không dung huyết ra xung quanh, màu xám tới xám trắng đôi khi có màu đỏ, khuẩn lạc có mặt lồi và rìa rõ ràng. Ở những lần nuôi cấy đầu tiên, khuẩn lạc có kích thước lớn nhất khoảng 1 – 3 mm sau khoảng 48 giờ sau nuôi cấy nhưng ở những lần sau thường khuẩn lạc nhỏ hơn và biến dạng không đồng nhất. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu đã được công bố của Võ Thị Trà An và cs. (2014).
Tiến hành phân lập vi khuẩn từ 50 con gà Lương Phượng ở mọi lứa tuổi có triệu chứng điển hình của ORT thu thập được tại các hộ chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh. Gà nghi mắc ORT được đưa về phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú Y để tiến hành phân lập vi khuẩn. Bằng phương pháp lấy mẫu và nuôi cấy, kết quả thu được sau 24 – 72 giờ nuôi trong tủ ấm 37ºC được trình bày trong bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn ORT thu thập được trên gà Lương Phượng tại tỉnh Bắc Ninh
STT Nhóm gà Mẫu
bệnh phẩm Số phân lập Số mẫu dương tính
Tỷ lệ (%)
1 0 – 6 tuần tuổi 26 78 19 24,36
2 Gà thịt 15 45 9 20,00
3 Gà đẻ 9 27 6 22,22
50 150 34 22,67
Ghi chú: mỗi con gà lấy 3 loại mẫu bệnh phẩm: dịch khí quản, phổi và túi khí
Thông qua bảng 4.9 cho thấy: Trong tổng số 150 mẫu được lựa chọn phân lập (mỗi con lựa chọn ra 3 cơ quan/ bộ phận: Khí quản, túi khí, phổi) có 34 mẫu cho kết quả dương tính, chiếm tỷ lệ 22,67%. Trong đó: gà 0 – 6 tuần tuổi tỷ lệ cao nhất với 24,36% (19 mẫu dương tính trong tổng số 78 mẫu phân lập). Tiếp theo là gà đẻ với 6 mẫu dương tính trong tổng số 27 mẫu phân lập chiếm 22,22%.
Gà thịt có tỷ lệ số mẫu dương tính thấp nhất khoảng 20% (9 mẫu dương tính trong tổng số 45 mẫu phân lập).
Sau khi tiến hành nuôi cấy, phân lập ORT trên môi trường thích hợp, tiến hành giám định một số đặc tính sinh hóa.
Mỗi loại vi khuẩn có các đặc tính sinh học khác nhau như: đặc tính sinh hóa, tính chất chuyển hóa các loại đường, khả năng sinh sản các hợp chất sinh học trung gian trong quá trình trao đổi chất vào môi trường nuôi cấy.
Từ kết quả nuôi cấy trên chọn khuẩn lạc đặc trưng để kiểm tra một số phản ứng sinh hóa (Catalase, Oxidase, Indol), kết quả được thể hiện thông qua bảng 4.10.
Bảng 4.10. Kết quả một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ORT
Hiện tượng
Catalase Oxidase Indol
Không có hiện tượng sủi bọt
Xuất hiện màu tím đen hoặc giấy đổi màu (màu xanh)
Không xuất hiện vòng tròn đỏ
Kết quả - + -
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy 100% số mẫu tiến hành giám định đặc tính sinh hóa cho các kết quả trùng khớp với các kết quả nghiên cứu trước đó của Charlton et al. (1993), Hafez (1996) với Catalase (-), Indol (-), Oxidase (+).
Trong quá trình tiến hành các thí nghiệm một số hình ảnh tương ứng với các kết quả nhận được ở hình 4.15, 4.16 và 4.17.
Hình 4.15. Kết quả kiểm tra phản ứng Catalaza của vi khuẩn ORT ORT-Catalaza (-)
Hình 4.16. Kết quả kiểm tra phản ứng Oxidase của vi khuẩn ORT ORT- Oxidase (-)
Hình 4.17. Kết quả kiểm tra phản ứng Indol của vi khuẩn ORT ORT- Indol (-)
Thông qua hình 4.15, 4.16 và 4.17 chúng tôi nhận thấy rằng với những khuẩn lạc của vi khuẩn ORT cho kết quả phản ứng Catalase âm tính, điều đó chứng tỏ vi khuẩn ORT không có men Catalase nên chúng không có khả năng phân hủy H2O2 tạo thành H2O và O2 vì vậy phản ứng không có bọt.
Ở phản ứng Oxidase dương tính chuyển thành màu tím than. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây của (Hafez HM and Mohammed Zahra, 2002).
Để thử phản ứng Indol, chúng tôi chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường trypton ủ 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ, sau đó nhỏ thuốc thử Indol vào cho kết quả âm tính (không xuất hiện vòng tròn màu hồng cánh sen). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây (Amonsin et al., 1997).
Sau khi thử các phản ứng sinh hóa cho kết quả xác định là vi khuẩn ORT, tiến hành chọn khuẩn lạc ở vị trí đánh dấu, sau đó tiến hành nhuộm gram theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất để xác định hình thái của chủng vi khuẩn ORT phân lập được tại các hộ chăn nuôi trên tỉnh Bắc Ninh.
Kết quả thu được thể hiện thông qua hình 4.18.
Hình 4.18. Hình thái vi khuẩn ORT dưới kính hiển vi
Kết quả hình 4.18 cho thấy: Vi khuẩn ORT phân lập được là gram âm (bắt màu đỏ) và rất đa dạng khi kiểm tra trên kính hiển vi.
Từ các kết quả trên, chúng tôi tiến hành xác định chính xác sự hiện diện của ORT trong một số mẫu đã phân lập cho kết quả dương tính, tách chiết DNA của vi khuẩn ORT và tiến hành thực hiện phản ứng PCR để kiểm tra có hay không có DNA của vi khuẩn ORT trong canh khuẩn. Kết quả phản ứng PCR được thể hiện thông qua hình 4.19.
Hình 4.19. Kiểm tra sản phẩm PCR của vi khuẩn ORT Kết quả được thể hiện thông qua bảng 4.11.
Bảng 4.11. Kết quả của phản ứng PCR ở các mẫu bệnh phẩm chẩn đoán bệnh do ORT
STT Cơ quan Số
lượng
Kết quả
Dương tính Tỷ lệ Âm tính Tỷ lệ
1 Dịch khí quản 12 10 83,33 2 16,67
2 Phổi 17 15 88,24 2 11,76
3 Túi khí 5 3 60,00 2 40,00
Kết quả hình 4.19 cho thấy: đối chứng dương lên vạch cho sản phẩm PCR nhỏ hơn 800bp (khoảng 784bp như trong thiết kế cặp mồi đặc hiệu). Đối chứng âm không lên vạch như trong thiết kế cặp mồi đặc hiệu; chứng tỏ phản ứng đặc hiệu, cho độ tin cậy cao trong quá trình phân tích và đánh giá kết quả. Các mẫu cần kiểm tra lên vạch, cho sản phẩm PCR nhỏ hơn 800bp (khoảng 784bp). Như vậy trong mẫu có chứa DNA của vi khuẩn ORT.
Qua bảng 4.11 cho thấy: các mẫu bệnh phẩm lấy để chẩn đoán ORT là các mẫu phổi và dịch khí quản, túi khí của gà có triệu chứng lâm sàng để khẳng định sự có mặt của vi khuẩn ORT trong các mẫu tiến hành nghiên cứu. Điều này chứng tỏ, vi khuẩn ORT tồn tại chủ yếu trên đường hô hấp của gà. Trong đó, dịch khí quản và phổi là nơi trú ngụ nhiều nhất của vi khuẩn ORT.