3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901
3.5.2 Đặc tính enzyme phytase thô
a/ Khả năng chịu nhiệt của enzyme phytase
Hình 29. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của phytase chủng SP1901 Một trong những ứng dụng lớn nhất của phytase là phụ gia thức ăn chăn nuôi.
Quá trình chế biến cũng như đóng gói, bao viên thức ăn thường diễn ra trong một
khoảng thời gian nhất định ở nhiệt độ cao trong khoảng từ 65-95oC, đòi hỏi các enyme bổ sung có khả năng chịu được nhiệt độ trong khoảng thời gian đó (có tính bền nhiệt). Độ bền nhiệt của các sản phẩm phytase thương mại trở thành mối quan tâm lớn trong nhiều thời gian gần đây và đã có nhiều những nỗ lực nghiên cứu được thực hiện nhằm nâng cao khả năng bền nhiệt của enzyme phytase. Đặc tính bền nhiệt của enzyme là do khả năng biến tính thuận nghịch và hồi tính, enzyme có thể bị biến tính khi xử lý nhiệt và sau đó lại có thể gấp nếp về dạng tự nhiên và tái biểu hiện hoạt tính. Phytase của chủng SP1901 cũng đã được thử nghiệm khả năng bền ở các nhiệt độ 60, 70, 80, 90oC bằng cách ủ enzyme ở các nhiệt độ trên trong 10, 20, 30 phút sau đó xác định hoạt tính phytase. Các kết quả ở hình 29 cho thấy, phytase của chủng SP1901 bền ở 60oC sau 30 phút xử lý, hoạt tính vẫn giữ được khoảng 90%, ở 70oC hoạt tính chỉ còn 28% sau 30 phút xử lý và ở 80, 90oC phytase mất toàn bộ hoạt tính. Như vậy enzyme phytase của chủng nghiên cứu bền ở 60oC trong 30 phút. Trong một nghiên cứu của Yetti Marlida và cộng sự (2010), phytase của nấm Fusarium verticillioides bền nhiệt ở 50oC/30 phút và bị bất hoạt nhanh chóng khi nhiệt độ tăng dần trên 50oC [157]. Trong nghiên cứu của Farhat và cộng sự (2008), phytase của chủng Bacillus subtilis US417 bền ở 50oC sau 30 phút xử lý tuy nhiên hoạt tính phytase chỉ còn 22% sau 10 phút xử lý ở 60oC [29]. Một số chủng khác thuộc chi Bacillus như chủng Bacillus sp. DS11, Bacillus sp. MD2 có khả năng sinh phytase bền nhiệt. Phytase của Aspergillus fumigatus có tính bền nhiệt cao, sau khi bị biến tính ở 90oC đã gấp nếp trở lại và giữ nguyên hoạt tính [149].
b/ Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt động của enzyme phytase
Hình 30. pH hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901
Hình 31. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901
Giá trị pH tối ưu có ảnh hưởng lớn đến tiềm năng ứng dụng của enzyme, đặc biệt là các enzyme được ứng dụng là phụ gia thức ăn chăn nuôi do ảnh hưởng của tính axit trong ống tiêu hóa của động vật. Phytase ở hầu hết các loài vi khuẩn thường có dải pH hoạt động tối ưu trong khoảng 4-5,5, tuy nhiên phytase của các loài thuộc chi Bacillus lại có khoảng pH hoạt động tối ưu cao hơn nằm trong khoảng 6,5-7,5 [96, 149]. Theo kết quả thu được ở hình 30 phytase của chủng SP1901 hoạt động tối ưu trong khoảng pH từ 5,6-7,2, ở pH dưới 3,2 phytase gần như không hoạt động được và từ pH trên 7,2, phytase giảm dần hoạt tính. Trong nghiên cứu của Gulati và cộng sự (2007) phytase tinh khiết của chủng Bacillus laevolacticus có pH hoạt động tối ưu là pH 7, ở pH 3 hoạt tính vẫn giữ được trên 20% và hoạt tính phytase cũng bắt đầu giảm dần khi pH trên 7. Theo một nghiên cứu mới đây của Moushree và cộng sự (2012), phytase của chủng Shigella sp. CD2 có pH hoạt động tối ưu là 5,5 [83].
Để nghiên cứu nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme phytase, chúng tôi đã tiến hàng ủ phản ứng enzyme - cơ chất ở các nhiệt độ 20, 30, 40, 50, 60, 70oC, sau đó xác định hoạt tính phytase. Với các kết quả thu được trong hình 31 phytase của chủng SP1901 có thể hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 40-60oC trong đó nhiệt độ thích hợp nhất là 50oC. Theo các kết quả nghiên cứu trước đây, phytase của B.
subtilis, E. coli, Enterobacter sp. 4, Klebsiella aerogenes, K. oxytoca MO-3,
Selenomonas ruminantium, Shigella sp. CD2 có nhiệt độ hoạt động tối ưu nằm trong khoảng 50-60oC, trong khi đó phytase của Bacillus sp. DS11 và Bacillus laevolacticus, Bacillus sp. MD2 có nhiệt độ hoạt động tối ưu là 70oC [37, 57, 83, 149].
d/ Ảnh hưởng của các ion kim loại
Hình 32. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của phytase chủng SP1901
Ảnh hưởng của các ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt động của phytase được khảo sát bằng cách xác định hoạt tính phytase trong sự có mặt của các ion và các hóa chất như: Zn2+, Mg2+, Mn2+, Ba2+, Ca2+, Cu2+, Na+, SDS, EDTA ở các nồng độ 1; 2; 5 mM. Theo kết quả thu được ở hình 32, sự có mặt của các enzyme như Ca2+ và Cu2+ ở nồng độ 2; 5 mM làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme, sự có mặt của SDS và Na+ ở các nồng độ 1; 2; 5 mM không làm thay đổi nhiều hoạt động của phytase, đặc biệt sự có mặt của EDTA ở nồng độ 1mM làm giảm một nửa hoạt tính phytase và EDTA ở nồng độ 2; 5 mM làm giảm toàn bộ hoạt tính phytase chứng tỏ phytase của SP1901 là loại phytase phụ thuộc kim loại. Sự có mặt của các ion kim loại khác như Zn2+, Mg2+, Mn2+, Ba2+ ở các nồng độ 1; 2; 5 mM làm giảm một phần hoạt tính phytase. Moushree và cộng sự (2012) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt động của phytase của chủng Shigella sp. CD2 và nhận thấy rằng
sự có mặt của Fe2+, Zn2+, Cu2+ và SDS(2 mM) làm giảm hoạt tính phytase chỉ còn 65, 72, 87, 4% trong khi đó sự có mặt của Ca2+, Mn2+, Mg2+ và Co2+ (2 mM) làm tăng hoạt tính phytase (tương ứng 119, 121, 135, 121%). Đặc biệt hoạt tính phytase không bị ức chế bởi sự có mặt của EDTA, do đó có thể cho rằng hoạt động chức năng của phytase từ Shigella sp. CD2 không hoàn toàn đòi hỏi sự có mặt của các ion kim loại. Các chất khử như 2- mercaptoethanol và cyscteine hydrochloride không ảnh hưởng đến hoạt động của phytase Shigella sp. CD2 [83]. Ngoài ra ảnh hưởng của các ion kim loại như Li+, Co2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Hg2+, Cs+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Ba2+, EDTA lên phytase của chủng Bacillus subtilis US417 cũng đã được nghiên cứu, trong đó đã nhấn mạnh phytase của Bacillus subtilis US417 là phytase phụ thuộc kim loại do sự có mặt EDTA 1mM ức chế hoàn toàn hoạt tính phytase [29]. Ngoài ra, nghiên cứu ảnh hưởng của ion kim loại lên phytase đã được nhiều tác giả công bố: phytase từ Enterobacter sp.4 bị ức chế mạnh bởi các ion Zn2+, Ba2+, Cu2+, Al3+ [160]. Phytase từ B. subtilis (natto) N-77 bị ức chế bởi các ion Zn2+, Cd2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+ và Al3+, hoạt tính phytase của Emericella nidulans và Aspergillus terreus CBS bị ức chế bởi 1 mM Cu2+, phytase từ A. fumigatus bị ức chế bởi Cu2+, Zn2+, Ca2+, Co2+, Mn2+, Ni2+ và Fe3+ (1 mM), trong khi đó EDTA (1 mM và 10 mM) làm tăng (~50%) hoạt tính enzyme [56, 156].
e/ Ảnh hưởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt của phytase
Hình 33. Ảnh hưởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở 60oC (phải), xử lý ở 70oC (trái)
Để nghiên cứu ảnh hưởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt enzyme, phytase của chủng SP1901 được ủ ở 60 và 70oC trong 10, 20 và 30 phút trong điều kiện có mặt và không có mặt Ca2+ 2 mM. Ở 60oC, khi có mặt Ca2+ và không có Ca2+ ủ với enzyme, độ bền nhiệt của phytase gần như nhau và chỉ giảm dưới 10% so với mẫu đối chứng, tuy nhiên khi xử lý enzyme ở nhiệt độ 70oC, mẫu enzyme không ủ với Ca2+ hoạt tính giảm chỉ còn 30% sau 30 phút, với mẫu enzyme được ủ với Ca2+
2mM hoạt tính enyme chỉ giảm dưới 10% so với mẫu đối chứng (hình 33). Điều đó chứng tỏ Ca2+ có ảnh hưởng tích cực đến độ bền nhiệt của enzyme phytase của chủng nghiên cứu. Kim và cộng sự (1998) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của Ca2+
đến độ bền nhiệt của phytase từ chủng Bacillus sp. DS11 và nhận thấy rằng hoạt tính phytase vẫn giữ được khoảng 50% khi enzyme được ủ ở 90oC trong 10 phút với sự có mặt của Ca2+ 5 mM [57]. Trong nghiên cứu của Thuy và cộng sự (2010), sự có mặt của Ca2+ 5mM đã làm tăng độ bền nhiệt của phytase của chủng Bacilus sp.
MD2 khi xử lý ở 70, 80, 90, 100oC. Sau 20 phút enzyme được xử lý nhiệt ở 70, 80, 90, 100oC có mặt Ca2+ 5 mM hoạt tính enzyme vẫn giữ lại khoảng 98, 64, 60, 23%
(lần lượt), sau 30 phút xử lý hoạt tính enzyme giữ lại được khoảng 97, 57, 38, 3%
(lần lượt). Như vậy Ca2+ có ảnh hưởng tích cực đến độ bền nhiệt của phytase chủng Bacilus sp. MD2 [139].
f/ Độ bền nhiệt của enzyme trên cơ chất sấy khô
Hình 34. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất được sấy khô ở 50oC trong 24h
Khi môi trường xốp sau lên men được sấy ở 50oC sau 24-48h và xử lý nhiệt với chính các mẫu lên men xốp đó lần lượt ở các nhiệt độ 60, 70, 80, 90oC trong 30 phút sau đó chiết xuất enzyme và xác định hoạt tính thì thấy khi cơ chất sấy khô được xử lý ở 90oC hoạt tính enzyme vẫn còn 12,5; 19,73 và 31% sau 30, 20, 10 phút xử lý nhiệt. Kết quả cho thấy khi enzyme vẫn ở trong cơ chất được sấy khô, chưa chiết xuất thì tính bền nhiệt của enzyme cao hơn (hình 34). Trong một nghiên cứu của Marshall và cộng sự (1980) cho rằng trong tự nhiên có nhiều enzyme ở dạng glycoprotein và đây là bằng chứng gợi ý rằng carbohydrate khi kết hợp với enzyme sẽ làm cho enzyme bền vững hơn nên các enzyme chứa carbohydrate bền hơn so với các enzyme không chứa carbohydrate, vì thế ông và cộng sự đã quan tâm đến việc cải thiện độ bền của enzyme bằng cách gắn chúng với carbohydrate. Với cách làm này có thể tăng độ bền enzyme khi bảo quản, hoạt tính enzyme vẫn giữ được trong các điều kiện sử dụng bất lợi, chống lại được các tác nhân ức chế enzyme tự nhiên và nhiều các đặc tính quý khác [74].
g/ Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của enzyme.
Hình 35. Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của phytase chủng SP1901
Một trong những yêu cầu cần thiết đối với enzyme ứng dụng trong chăn nuôi là phải có khả năng chống chịu được hệ enzyme thuỷ phân trong đường tiêu hoá của động vật. Đặc tính này giúp enzyme thực hiện chức năng xúc tác sinh học trong đường tiêu hoá. Chính vì vậy việc nghiên cứu khả năng mẫn cảm với những enzyme
thuỷ phân chủ yếu trong đường tiêu của động vật có ý nghĩa quyết định đến cách ứng dụng của enzyme. Theo kết quả nhận được trong hình 35, phytase của chủng SP1901 không bị ảnh hưởng bởi trypsin 0,1 mg/ml pH 8 tuy nhiên lại khá mẫn cảm với pepsin (hoạt tính giảm chỉ còn gần 30% sau 30 phút tiếp xúc với pepsin). Kết quả này cũng trùng với kết quả nghiên cứu của Powar và cộng sự (1982) khi cho rằng phytase từ Bacillus substilis rất bền dưới tác động của papain, pancreatin, trypsin và elastase tuy nhiên enzyme này lại mẫn cảm với pepsin [101]. Ở các loại phytase khác nhau thì khả năng kháng các enzyme thủy phân protein như pancreatic và pepsin là khác nhau. Phillippy BQ (1999) cho rằng các phytase sẵn có trong lúa mỳ dễ bị bất hoạt bởi pepsin hơn là phytase của A. niger do khi ủ phytase của A.
niger và lúa mỳ với 5mg pepsine/ml ở pH 3,5; phytase A. niger vẫn giữ được 95%
hoạt tính còn phytase trong lúa mỳ chỉ còn giữ 70% hoạt tính ban đầu [100].
Igbasan và cộng sự (2000) cho rằng phytase của E. coli không mẫn cảm với pepsine và pancreatine [49]. Phytase của chủng Shigella sp. CD2 giữ được khoảng 80% hoạt tính sau khi xử lý với pepsine và trypsin 0.1mg/ml trong 60phút và phytase tái tổ hợp từ A. niger trên P. pastoris trong nghiên cứu của Ngô Thanh Xuân và cộng sự (2011) không mẫn cảm pepsin (2000 U/ml, pH 2) nhưng mẫn cảm với pancreatin (2 mg/ml) [2, 83]. Các sản phẩm phytase thương mại cần có tính kháng các protease trong suốt hệ tiêu hóa của động vật dạ dày đơn tuy nhiên đối với các enzyme không có đặc tính này, để khắc phục điều này enzyme phytase có thể được bọc bằng vỏ bọc để vượt qua các khu vực khác nhau trong đường tiêu hóa của động vật. ?
Như vậy với các kết quả nghiên cứu đặc tính enzyme phytase của chủng SP1901 cho thấy rằng: phytase của chủng bền ở 60oC (vẫn giữ được 90% hoạt tính sau 30 phút xử lý ở 60oC), hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50oC. Sự có mặt của Ca2+ và Cu2+ làm tăng nhẹ hoạt tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2mM trở lên làm ức chế hoàn toàn hoạt tính phytase. Ca2+ làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60 và 70oC, khi không có mặt Ca2+ ở 70oC sau 30 phút xử lý hoạt tính chỉ còn 28%
tuy nhiên khi có mặt Ca2+, sau khi xử lý 30 phút ở 70oC hoạt tính vẫn giữ được 95%
hoạt tính. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, sau 30
phút xử lý ở lần lượt 60, 70 và 80oC hoạt tính phytase giữ được 90, 77 và 49%, sau 10 phút xử lý ở 90oC hoạt tính phytase chỉ còn 31%. Phytase của chủng SP1901 bền với enzyme tiêu hóa trypsine 0,1mg/ml pH 8 khi được ủ với trypsine trong 30 phút và bị giảm dần hoạt tính khi tăng dần thời gian ủ với pepsine 10 mg/ml pH 3.
KẾT LUẬN
- Từ 346 chủng, đã sàng lọc được 91 chủng chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng được ở 40oC. Các chủng này được nuôi trên môi trường PSM, định lượng trên môi trường dịch thể, lên men xốp và kiểm tra khả năng bền nhiệt đã chọn được chủng SP1901 có hoạt tính phytase cao và bền nhiệt.
- Chủng SP1901 được định danh là loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum dựa trên phân tích trình tự ADNr 16S và trình tự kết nối của 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL, 16S rRNA.
- Điều kiện nhân giống thích hợp của chủng SP1901: môi trường thạch thường ở 40oC, pH 6, điều kiện hiếu khí sau 16-24 h nuôi cấy.
- Điều kiện lên men xốp thích hợp của chủng SP1901 cho hoạt tính phytase cao nhất: cơ chất là ngô vỡ (đạt 4,68U/g), độ ẩm là 50%, tỷ lệ cấy giống phù hợp nhất là từ 10-20% và sau 84 h nuôi cấy, nguồn cacbon là lactose, glycerol, sucro, CMC và nguồn nitơ là ure. Ion Ca2+ có vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp phytase ở nồng độ 0,2-0,8%.
- Thu hồi enzyme bằng dung dịch chiết SDS 1% và nước máy cho hiệu quả chiết xuất cao nhất (5,74 và 5,54 U/g). Phytase bị mất hoạt tính hoàn toàn ở tất cả các phân đoạn khi tủa bằng (NH4)2SO4, khi tủa bằng cồn và acetone phytase tủa nhiều nhất ở nồng độ 70% đạt 91-95%.
- Phytase của chủng SP1901 bền ở 60oC, hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50oC. Sự có mặt của Ca2+ và Cu2+ làm tăng hoạt tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2 mM làm ức chế hoàn toàn hoạt tính phytase. Ca2+ làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60oC và 70oC. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, phytase của chủng SP1901 mẫn cảm với pepsine và không mẫn cảm với trypsin.
KIẾN NGHỊ
- Tinh sạch enzyme để sản xuất enzyme dưới dạng các chế phẩm thương mại;
- Tìm kiếm các khả năng sinh các loại enzyme khác nhau của chủng nghiên cứu.
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Ngô Thanh Xuân (2011), Nghiên cứu phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP trong Pichia pastoris và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi. Luận án tiến sĩ, Đại học sư phạm Hà Nôi.
3. Nguyễn Thùy Châu (2009), Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp. Báo cáo dự án khoa học kỹ thuật - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
TIẾNG ANH
4. Anderson RJ (1914), A contribution to the chemistry of phytin. I. Composition of barium phytate and phytic acid. II. A study of the properties of phytic acid and its decomposition products. Eighth paper on phytin. Journal Biological Chemistry 17: 171-190.
5. Angel R, Tamim NM, Applegate TJ, Dhandu AS, Ellestad LE (2002), Phytic acid chemistry: influence on phytin-phosphous availability and phytase efficacy. Journal Applied Poultry Research 11: 471-480.
6. Alvarez F, Castro M, Principe A, Borioli G, Fischer S, Mori G & Jofre E (2012), The plant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and ARP2 3 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease. Journal of applied microbiology 112(1): 159-174.
7. Arguelles-Arias A, Ongena M, Halimi B, Lara Y, Brans A, Joris B & Fickers P (2009), Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens. Microbial Cell Factories 8: 63.
8. Ash C, Farow JAE, Wallbanks S & Collins MD (1991), Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small- subunit-ribosomal RNA sequences. Letters in Applied Microbiology 13(4):
202-206.
9. Bae HD, Yanke LJ, Cheng KJ, Selinger LB. (1999), A novel staining method for detecting phytase activity. Journal of Microbiological Methods - Elsevier 39(1):17-22.
10. Baldi BG, Franceschi VR, Loewus FA (1987), Localization of phosphous and cation reserves in Lilium longiflorum pollen. Plant Physiology 83(4): 1018- 1021.
11. Billington DC, editor (1993), The inositol phosphates: chemical synthesis and biological significance. Weinheim Verlag Chemic: 153.
12. Bogar B, Szakacs G, Linden JC, Pandey A, Tengerdy RP. 2003, Optimization of phytase production by solid substrate fermentation. Journal of industrial microbiology and biotechnology 30(3):183-9.
13. Borriss R, Chen XH, Rueckert C, Blom J, Becker A, Baumgarth B, Fan B, Pukall R, Schumann P, Sprửer C, Junge H, Vater J, Pỹhler A, Klenk HP.
(2011), Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens subsp. nov. and Bacillus amyloliquefaciens subsp.
plantarum subsp. nov. based on complete genome sequence comparisons.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 61(8):
1786-1801.
14. Bourdillon J (1951), A crystalline bean seed protein in combination with phytic acid. Journal Biological Chemistry 189(1): 65-72.
15. Byrd CA, Matrone G (1965), Investigations of chemical basis of zinc-calcium- phytate interaction in biological systems. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 119: 347-349.
16. Cao H, He S, Wei R, Diong M & Lu L (2011), Bacillus amyloliquefaciens G1:
A Potential Antagonistic Bacterium against Eel-Pathogenic Aeromonas hydrophila. Evid Based Complement Alternat Med 2011: 7.
17. Caldwell AG, Black CA (1958), Inositol hexaphosphate. III. Content in soils.
Soil Science Society of America Journal 22: 290-293.
18. Cheryan M (1980), Phytic acid interaction in food systems. CRC critical reviews in food science and nutrition 13: 297-335.
19. Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, Heinemeyer I, Morgenstern B, Voss B, Hess WR, Reva O, Junge H, Voigt B, Jungblut PR, Vater J, Süssmuth R, Liesegang H, Strittmatter A, Gottschalk G, Borriss R.
(2007), Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nature Biotechnol 25(9): 1007-1014.
20. Choi YM, Suh HJ, Kim JM (2001), Purification and properties of extracellular phytase from Bacillus sp KHU-10. Journal of Protein Chemistry 20(4): 287- 292.