3.3. Khả năng ức chế của các nano kim loại Ag và Cu đến sự sinh trưởng của nấm Penicillium digitatum N11 và Colletotrichum gloeosporioides N8
3.3.1. Giai đoạn bào tử
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu được áp dụng nhằm xác định nồng độ chất kháng nấm nhỏ nhất ức chế được sự phát triển của vi sinh vật, làm cơ sở cho lựa chọn và tính toán liều lượng chất kháng nấm cần sử dụng.
41
Trong nghiên cứu dưới đây, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ tiêu diệt (MFC) của các nano Ag và nano Cu đến khả năng phát triển của bào tử nấm P. digitatum N11 và nấm C. gloeosporioides N8 được trình bày ở Bảng 5, Bảng 6, Hình 7 và 8.
Bảng 5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt (MFC) của nano kim loại Ag và Cu đối với bào tử nấm P. digitatum N11
Nano kim loại MIC (ppm) MFC (ppm)
Cu 500 1000
Ag 12,5 400
AgH 0,098 0,098
Carbendazim 400 400
Kết quả phân tích cho thấy, nano Cu thể hiện hiệu quả ức chế bào tử nấm P.
digitatum phát triển ở nồng độ 500 ppm và nano Ag ức chế ở nồng độ thấp hơn (12,5 ppm) và thể hiện nồng độ tiêu diệt ở nồng độ 400 ppm. Sau 3 ngày xử lý với nano trong ống nghiệm, trang đĩa kiểm tra khả năng hình thành khuẩn lạc trên môi trường PDA. Kết quả trên Hình 7 cho thấy, khi sử dụng nano Ag và Cu, nấm N11 bị ức chế và làm mất khả năng nảy mầm bào tử tạo khuẩn lạc ở các nồng độ kiểm tra.
Ở nồng độ Ag là 400 ppm nấm N11 mất hoàn toàn khả năng phát triển từ bào tử thành hệ sợi nấm. Với mật độ bào tử ban đầu 106 CFU/ml, số bào tử phát triển thành khuẩn lạc chỉ còn dưới 3 khuẩn lạc khi xử lý với nano Cu ở nồng độ 1000 ppm.
Như vậy ở nồng độ này khả năng tiêu diệt bào tử nấm bệnh lên đến trên 99 %. Ở nồng độ 500, nano Cu tiêu diệt bào tử nấm bệnh từ 30 %. Và nano AgH ức chế mạnh sự phát triển của bào tử nấm mạnh nhất với MIC và MFC đều là 0,098 ppm.
42
a
b c
d e
Hình 7. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các nano kiểm tra với bào tử nấm N11(a) với nano Cu (b), nano AgH (c), nano Ag (d) và Carbendazim (e)
Bảng 6. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và tiêu diệt (MFC) của các chất nghiên cứu đối với bào tử nấm C. gloeosporioides N8
Chất kiểm tra MIC (ppm) MFC (ppm)
Cu 1000 2000
Ag 50 100
AgH 0,098 0,195
Carbendazim >400 >400
43
a
b
c
d e
Hình 8. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với bào tử nấm N8 (a) với nano Cu (b), nano Ag (c), nano AgH (d) và Carbendazim (e)
Đối với nấm N8, kết quả cho thấy các hạt nano ức chế sự hình thành các khuẩn lạc của nấm ở các nồng độ khác nhau. MIC của nano Cu và Ag tương ứng là 1000 ppm và 50 ppm. Nano Cu ở nồng độ trên 2000 ppm và nano Ag 100 ppm làm chết hoàn toàn sự phát triển của bào tử nấm bệnh. Với các nồng độ thấp hơn 50 ppm đối với nano Ag và 1000 ppm của nano Cu gây ức chế trên bào tử nấm đến trên 90% (Hình 10). Riêng nano AgH có sự kết hợp giữa nano Ag và H2O2 trong quá trình sản xuất, cho thấy khả năngức chế mạnh sự phát triển của bào tử nấm với
44
MIC và MFC lần lượt là 0,098 và 0,195 ppm, thể hiện hiệu quả kháng nấm N8 mạnh nhất trong các nano nghiên cứu.
a
b
Hình 9. Đánh giá mức độ tác động của nano với nấm N11 ở giai đoạn bào tử với nano Ag (a), nano Cu (b)
a
b
45
c
Hình 10. Ảnh hưởng của nano đến khả năng phát triển hình thành khuẩn lạc của nấm N8 ở giai đoạn bào tử với nano AgH (a), nano Ag (b), nano Cu (c)
Hiệu quả ức chế nấm của hai nano kim loại Ag và Cu trong thí nghiệm của này phù hợp với thứ tự công bố của Zhao và Stevens (1998) về hiệu quả ức chế của các nano với vi sinh vật là Ag > Hg > Cu > Cd > Cr > Pb > Co > Au > Zn > Fe >
Mn > Mo > Sn [49].
Carbendazim là chất diệt nấm được sử dụng trên toàn thế giới như phương thức điều trị trước và sau thu hoạch để kiểm soát các bệnh nấm trên nhiều loại cây, trái cây như chuối, xoài, dâu tây, dứa, ngũ cốc, củ cải đường, cây cảnh, thảo dược và cam. Tại Châu Âu và Mỹ, carbendazim đã bị cấm sử dụng do những tác động đến sức khỏe con người [40] và ở Việt Nam hiện nay, thuốc hóa học này cũng không được sử dụng trong diệt nấm trên rau quả. Ở nồng độ 400 ppm, carbendazim tiêu diệt được bào tử nấm N11, tương đương với nồng độ tiêu diệt của nano Ag, thấp hơn MFC của nano Cu, và cao hơn MFC của nano AgH gần 40 lần.
Carbendazim nồng độ 400 ppm không ức chế hoàn toàn bào tử nấm N8 phát triển, cho thấy khả năng kháng nấm thấp khi so sánh với hiệu quả tiêu diệt của nano Ag nồng độ 100 ppm và nano AgH 0,195 ppm. Điều này chứng tỏ nano kim loại có khả năng kháng nấm hiệu quả với liều lượng thấp hơn hàng trăm lần so với chất diệt nấm và có thể sử dụng để thay thế các hóa chất độc hại.
Nano kim loại thể hiện khả năng kháng nấm khác nhau với các loại nấm khác nhau. Trong nghiên cứu này, với các nano được sản xuất tại Viện Công nghệ môi trường, MFC của nano Cu với nấm N8 cao hơn 2 lần MFC với nấm N11,
46
chứng tỏ nano Cu diệt nấm N11 hiệu quả hơn nấm N8. Mặt khác, nano Ag có MFC với nấm N8 bằng ẳ MFC với nấm N11, do đú, N8 nhạy cảm với nano Ag hơn nấm N11. Nano AgH thể hiện hiệu quả diệt bào tử của cả hai nấm mạnh nhất trong các nano khảo sát. Đã có nhiều nghiên cứu khác chứng minh nano Ag có khả năng kháng nấm và trong hầu hết các trường hợp, sự ức chế nấm gây bệnh thực vật được ghi nhận ở nồng độ 100 ppm, cao gấp 8 lần nồng độ nano Ag ức chế nấm P.
digitatum (12,5 ppm) trong nghiên cứu này. Mahdizadeh và cộng sự đã báo cáo rằng dung dịch nano Ag nồng độ 35 ppm ức chế được Aspergillus, Penicillium và Trichoderma. Nguyên nhân của sự khác nhau này có thể do đặc tính của nano sản xuất và chủng nấm kiểm định. Kanhed và cộng sự (2014) đã nghiên cứu khả năng ức chế của nano Cu với các nấm gây bệnh ở thực vật như Phoma destructiva, Curvularia lunata, Alternaria alternata và Fusarium oxysporum nhưng chưa có nghiên cứu cụ thể nào trên nấm Penicillium sp. [21]. Tuy nhiên, những các báo cáo về giá trị MFC dao động trong phạm vi rộng.