Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp điều tra hiện trạng bệnh hại cây có múi sau thu hoạch - Phương pháp điều tra theo Bộ NN&PTNT: "Quy chuẩn kỹ thuật Quốc Gia về phương pháp phát hiện dịch hại trên cây có múi. QCVN 01 - 119:
2012/BNNPTNT".
- Điều tra tại các khu chợ khác nhau trên địa bàn TP Hà Nội. Mỗi chợ điều tra 5 loại quả cây có múi: cam Văn Giang, cam sành, quýt, bưởi da xanh và bưởi Diễn. Lấy mẫu ở 10 thùng khác nhau, mỗi thùng điều tra 20 quả. Tổng số quả điều tra cho mỗi giống là 200 quả.
3.4.2. Phương pháp phân lập, chẩn đoán bệnh hại
Theo phương pháp của Lester W. Burgess et al. (2009) và Bùi Đông Hồ (2012):
- Mẫu quả bệnh được thu về, phân loại theo triệu chứng bệnh. Tiến hành phân lập tác nhân gây bệnh.
- Chọn các mẫu có vết bệnh mới, chọn mô có cả phần không bị và mô bị bệnh. Khử trùng bằng cồn 70º, rửa lại bằng nước cất vô trùng và để khô trên giấy thấm tiệt trùng. Sử dụng panh và kéo cắt nhỏ mô bệnh và đặt trên đĩa môi trường PDA ẳ cú thể bổ sung khỏng sinh.
- Để các đĩa petri đã phân lập trong tủ định ôn. Kiểm tra và ghi nhận sự phát triển của nấm.
- Nhận diện các mẫu nấm phân lập được, tiến hành cấy truyền, làm thuần và bảo quản mẫu nấm để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
- Đánh giá, định danh và làm thuần các loài vi sinh vật phân lập được.
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh thái của nấm
Theo phương pháp nghiên cứu BVTV ở quyển I, II, III năm 1997, 2000.
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ với tác nhân gây bệnh.
- Các ngưỡng nhiệt độ trong thí nghiệm: 20 oC, 25 oC, 30 oC. Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA, WA các ngưỡng nhiệt độ này được bố trí ổn định trong tủ định ôn. Mỗi mức nhiệt độ được nhắc lại 3 lần.
- Chỉ tiêu theo dõi: đường kính tản nấm sau 1, 3, 5, 7 ngày.
3.4.4. Phương pháp nghiên cứu hiệu lực của một số thuốc hóa học, chế phẩm sinh học đối với nấm Penicillium spp. trong điều kiện invitro
3.4.4.1. Nghiên cứu hiệu quả ức chế của một số chế phẩm sinh học và hóa học đối với nấm Penicillium spp. trong điều kiện invitro
Một số các vật liệu, hoạt chất như chitosan, saponin, muối NaHCO3, EDTA được phép sử dụng trong bảo quản một số loại quả ở Việt Nam. Các hóa chất trên được bổ sung trực tiếp vào môi trường PDA ở nhiệt độ 40 – 45 oC.
Các thí nghiệm được bố trí như sau:
Thí nghiệm 1: Hiệu quả ức chế của chitosan đối với nấm Penicillium spp. trong điều kiện invitro
CT1: PDA + 2 % chitosan CT4: PDA + 3,5 % chitosan CT2: PDA+ 2,5 % chitosan CT5: PDA + 4 % chitosan
CT3: PDA + 3 % chitosan CT đối chứng: PDA
Thí nghiệm 2: Hiệu quả ức chế của saponin đối với nấm Penicillium spp.
trong điều kiện invitro
CT1: PDA + 0,5 mg/ml saponin CT4: PDA + 4 mg/ml saponin CT2: PDA+ 1 mg/ml saponin CT đối chứng: PDA
CT3: PDA + 2 mg/ml saponin
Thí nghiệm 3: Hiệu quả ức chế của muối NaHCO3 đối với nấm Penicillium spp. trong điều kiện invitro
CT1: PDA + 2 % NaHCO3 CT4: PDA + 5 % NaHCO3
CT2: PDA+ 3 % NaHCO3 CT đối chứng: PDA
CT3: PDA + 4 % NaHCO3
Thí nghiệm 4: Hiệu quả ức chế của muối EDTA (4Na) đối với nấm Penicillium spp. trong điều kiện invitro
CT1: PDA + 0,01 M EDTA CT4: PDA + 0,04 M EDTA
CT2: PDA+ 0,02 M EDTA CT đối chứng: PDA
CT3: PDA + 0,03 M EDTA
- Lượng EDTA cần sử dụng được tính theo công thức:
CM x M x V Trong đó: V - thể tích cần pha (ml) m= x 100 m- khối lượng cần cân (g) 1000 M- Khối lượng mol (g/mol)
CM – nồng độ mol (mol/L) - Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần.
- Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm bộ môn bệnh cây, khoa Nông học.
- Thời gian thực hiện: từ tháng 10 – 12/2016.
- Đánh giá hiệu quả các vật liệu, hoạt chất: đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày sau cấy và đánh giá hiệu quả ức chế nấm.
3.4.4.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Chuẩn bị dung dịch lây nhiễm:
- Sau khi nguồn P.digitutum và P. italicum được nuôi cấy trên môi trường PDA (potato dextrose agar) trong vòng 7 ngày thì được sủ dụng để làm dung dịch lây bệnh.
- Trong ống nghiệm vô trùng, bào tử được cho vào ống nghiệm với 100 ml nước vô trùng. Lắc mạnh trong 5 phút để bào từ phân tán đều ra dung dịch nước cất. Kiểm tra nồng độ bào tử trong dung dịch bằng buồng đếm bào tử cho đến khi đạt 105 bào tử/ml là được.
Chuẩn bị quả để lây nhiễm nhân tạo:
- Lây nhiễm nhân tạo: quả cây có múi được sử dụng cho thí nghiệm đảm bảo sạch bệnh, đồng đều về màu sắc, kích thước, không bị sây sát, thối hỏng. Quả được rửa sạch bằng nước cất sau đó xịt cồn 70o và để khô trong điều kiện phòng thí nghiệm. Lây nhiễm nhân tạo bằng cách tạo 4 vết thương sâu khoảng 2 mm phân bố đều trên bề mặt quả. 1ml dung dịch bào tử đã được chuẩn bị tiêm vào mỗi vết thương sau đó quả được giữ trong vòng 2 h rồi tiến hành bước tiếp theo.
3.4.4.3. Thí nghiệm phòng trừ bệnh sau thu hoạch
- Dựa vào kết quả thí nghiệm invitro để lựa chọn nồng độ thích hợp có hiệu quả ức chế nấm cao tiến hành thí nghiệm xử lý mẫu quả.
- Quả được thu hái tại vườn với độ đồng đều về độ chín, kích thước, không bị sây sát, không biểu hiện triệu chứng bệnh. Rửa sạch quả bằng nước. Nhúng quả trong cồn 70o trong 1 phút. Để khô quả trong điều kiện phòng.
- Lây nhiễm nhân tạo với tác nhân gây thối quả theo cách đã nêu ở trên.
- Xử lý các mẫu quả bằng một số hoạt chất hóa học và sinh học như chitosan, saponin, muối EDTA, NaHCO3 và công thức đối chứng không xử lý.
- Một số thử nghiệm phòng trừ được bố trí như sau:
+ Quả được lõy nhiễm nhõn tạo bằng 20 àL dung dịch bào tử nấm P.itatlicum và P.digitatum nồng độ 106 bào tử/ml (E. Wuryatmo et al., 2014) sau 2h thì xử lý bằng các hóa chất: EDTA 0,04 M, saponin 2 mg/ml, chitosan 2 %, NaHCO3 3%.
+ Quả không lây nhiễm nhân tạo xử lý bằng các hóa chất: EDTA 0,04 M, saponin 2 mg/ml, chitosan 2 %, NaHCO3 3 % sau 1 ngày phun dung dịch bào tử lên quả.
+ Quả trong các thí nghiệm được bảo quản trong các túi nilon và bảo quản trong nhiệt độ phòng 25 oC.
- Theo dõi và đánh giá hiệu quả của vật liệu, chế phẩm dựa trên đánh giá tỷ lệ bệnh %, thời gian tiềm dục, hiệu lực ức chế trên quả sau khi xử lý.
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn trong phòng thí nghiệm với 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại 4 vết bệnh mỗi công thức. Đối với thí nghiệm phòng, trừ bệnh quả được theo dõi trong vòng 7 ngày sau xử lý. Thí nghiệm thời gian bảo quản quả sẽ được bảo quản trong vòng 4 tuần.