CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2.6. Đánh giá các chỉ số miễn dịch của tôm
Một số chỉ tiêu miễn dịch điển hình ở tôm được đánh giá trong nghiên cứu này bao gồm: mức độ biểu hiện gen Rho/Ran; hoạt tính enzyme PO/SOD (đã được đề cập như trong phần Tổng quan tài liệu), mẫu mô cơ tôm và tim tôm được thu tại các thời điểm 0 D và 28 D, với n = 3, cụ thể như sau:
2.2.6.1. Đánh giá mức độ biểu hiện mRNA Rho/Ran:
Tại các thời điểm 0 D và 28 D, tiến hành thu mẫu tôm (n = 3) và giải phẫu thu khoảng 10 - 30 mg phần mô cơ tôm ngay dưới lớp vỏ kitin, gần đầu tôm. Bảo quản lạnh phần cơ tôm thu được, giã nhuyễn trong nitơ lỏng để đảm bảo chất lượng RNA và tiến hành tách chiết RNA sử dụng Kit Quiagen Rneasy Mini Kit (Quiagen, Đức). Sau khi tỏch chiết, tiến hành đo xỏc định nồng độ (àg/ml) và độ tinh sạch (A260/A280) của RNA tổng số bằng máy quang phổ Nano DropOne Microvolume UV-VIS (Thermo Scientific, USA). RNA sau đó được chia nhỏ, bảo quản ở -80°C để đảm bảo RNA
Luận văn thạc sĩ Khoa học
35
không bị phân hủy, một phần được dùng làm khuôn phản ứng tạo cDNA sử dụng enzyme phiên mã ngược (M-MLV reverse transcriptase), với thành phần được liệt kê trong phần Nguyên liệu và chu trình gồm: ủ phản ứng trong 10 phút ở 25°C, 60 phút ở 42°C, 5 phút ở 95°C.
Bảng 2.3: Trình tự các cặp mồi và probe sử dụng trong nghiên cứu S
TT
Gen đích
cDNA
(bases) Primer và probe
Tài liệu tham khảo 1
1 Rho 180
Fw: 5’ - gaaaatattccagaaaaatggacg - 3’
Rv: 5’ - tttatcttctcagccatgttacga - 3’ Nghiên cứu này
2
2 Ran 280
Fw: 5’ - aggtccatcctctcgttttc - 3’
Fw: 5’ - gcccatctacgagggatat - 3’
P:
/5HEX/atactgctg/ZEN/gccaagagaagttgg gagg/3IABkFQ/
Nghiên cứu này
3 3
-actin 122
Fw: 5’ - gcccatctacgagggatat - 3’
Rv: 5’ - ggtggtcgtgaaggtgtag - 3’ [43]
4 4
BaqA- SH6
110
Fw: 5’ - gggtaccatggctattggattgagga - 3 Rv: 5’ - actttcatatcccgtttatgtgcttct - 3’
P:
/56/FAM/accgaagaa/ZEN/catttcggctcca tgaagac/3IABkFQ/
Nghiên cứu này
Luận văn thạc sĩ Khoa học
36
Sản phẩm tạo cDNA được dùng làm khuôn cho phản ứng Real-time PCR sử dụng tín hiệu SYBR Green (TOPreal™ qPCR 2X PreMIX, Enzynomics, Hàn Quốc) nhằm nhân đoạn gen 180 bp của mRNA Rho cDNA và phản ứng Real-time PCR sử dụng Taqman FAM-probe (RbTaq™ Fast qPCR 2X PreMIX, Enzynomics, Hàn Quốc) để nhân đoạn gen 280 bp của mRNA Ran cDNA. Song song với phản ứng PCR nhân gen đích Rho/Ran, gen nội chuẩn β-actin, nhân đoạn gen đặc hiệu 122 bp trên tôm [78]
được sử dụng để đánh giá chính xác mức độ biểu hiện của mRNA Rho/Ran. Hệ thống các cặp mồi và probe đặc hiệu (Rho/Ran/β-actin) được trình bày trong Bảng 2.3. Cuối cùng, mức độ biểu hiện gen Rho/Ran được tính theo công thức đã được trình bày và phân tích bởi Livak và cộng sự: 2-ΔΔCt [43], trong đó, Ct là giá trị chu kỳ ngưỡng của mỗi phản ứng Real-time PCR trên từng đối tượng gen đích.
2.2.6.2. Đánh giá hoạt tính enzyme PO/SOD
Tiến hành thu mẫu tại thời điểm 0 D và 28 D, phần tim tôm được sử dụng cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme PO và mô cơ tôm được dùng cho thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme SOD.
Hoạt tính enzyme PO: Hoạt tính enzyme PO được xác định theo phương pháp của Hernández-López và cộng sự (1996) [30]. Tim tôm sau khi giải phẫu được giữ lạnh, nghiền nhuyễn trên đá để bảo toàn hoạt tính enzyme, sau đó bổ sung đệm cacodylate (thành phần đệm trình bày trong phần Nguyên liệu), vontex để tạo dung dịch đồng nhất chứa enzyme PO. Tỷ lệ mẫu/đệm là 1 mg tim/4 àl đệm cacodylate. Ly tâm dung dịch đồng nhất trên ở 4°C, tốc độ 7500 vòng/phút trong vòng 10 phút, thu dịch nổi chứa enzyme PO. 50 àl dịch nổi được ủ với 50 àl trypsin (xem phần Nguyờn liệu) ở 25°C, 30 phỳt trước khi bổ sung 50 àl L-DOPA (xem phần Nguyờn liệu). Giếng đối chứng chỉ chứa đệm 100 àl cacodylate và 50 àl L-DOPA. Hoạt tớnh enxyme PO được xác định dựa vào khả năng hình thành phức chất dopachrome, dopachrome hấp thụ bước sóng 490 nm. Sau khi ủ mẫu, sử dụng hệ thống máy Multiplex Absorbance
Luận văn thạc sĩ Khoa học
37
Reader (BioRad, USA) để đo quang phổ hấp phụ (A490). Giá trị ΔA490 = A490 (60 phút) - A490 (0 phút) là chỉ số đánh giá hoạt tính enzyme PO ở mỗi mẫu.
Hoạt tính enzyme SOD: Quy trình xác định hoạt tính enzyme SOD được thực hiện theo phương pháp được trình bày trong nghiên cứu của McCord và Fridovich năm 1969 [46]. Cụ thể, trong phương pháp này, mô cơ tôm được giữ lạnh, giã nhuyễn và bổ sung đệm phosphate 216 mM, pH 7,8 theo tỷ lệ 1 mg mụ cơ tụm : 4àl đệm phosphate, ly tâm dung dịch đồng nhất ở 4°C, tốc độ 7500 vòng/phút, 10 phút; thu pha trên chứa enzyme SOD bằng máy quang phổ UV-Vis ở bước sóng 550 nm (A550). Hoạt tính enzyme SOD được xác định là số đơn vị enzyme cần để ức chế 50 % phản ứng khử cytochrome C bởi gốc superoxide O2-, theo loạt phản ứng sau:
(1) Xanthin + O2 + 2H2O 𝑋𝑂𝐷→ axit Uric + 2O2- + 4H+ (2) Cytochrome3+ C + O2- → Cytochrome2+ C + O2
(3) O2- + H+𝑆𝑂𝐷→ O2 + H2O2
Trong hỗn hợp phản ứng, ban đầu, dưới sự xúc tác của enzyme xanthin oxidase (XOD), muối xanthin trong nước sẽ bị thủy phân thành axit uric, cation H+ và gốc superoxide O2-. Sau đó, cytochrome C trong hỗn hợp sẽ bị khử bởi O2- giải phóng bởi phản ứng (1). Tuy nhiên, enzyme SOD xúc tác cho phản ứng kết hợp O2- và H+ tạo thành oxy phân tử và H2O2 (3), phản ứng này cạnh tranh gốc superoxide với phản ứng khử cytochrome C (2). Do đó, nếu trong hỗn hợp phản ứng có chứa SOD, thì phản ứng khử cytochrome C sẽ bị ức chế. Hoạt tính enzyme SOD được xác định theo công thức sau:
% Ức chế = 𝛥A550(XOD)− 𝛥𝐴550(𝑆𝑂𝐷)
𝛥𝐴550(𝑋𝑂𝐷)
Đơn vị enzyme/ml = % Ứ𝑐 𝑐ℎế
50% ×V Hoạt tính enzyme/1 g mô tôm = Đơ𝑛 𝑣ị 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒/𝑚𝑙
𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑚ô 𝑡ô𝑚
Luận văn thạc sĩ Khoa học
38