CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG HỖN HỢP
3.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp
Nghiên cứu đặc tính điện hóa của hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat
Để nghiên cứu đặc tính điện hóa của atorvastatin và fenofibrat trên điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE), chúng tôi tiến hành ghi đường von-ampe vòng của dung dịch hỗn hợp atorvastatin 5.10-6 M và fenofibrat 15.10-6 Mvới các điều kiện pH = 6,5, khoảng thế từ -0,25 V đến -1,5 V, tốc độ quét thế 100mV/s, kết quả thu được như hình 3.20.
-600m -800m -1.00 -1.20 -1.40
U (V) -30.0n
-20.0n -10.0n 0
I (A)
Hình 3.20: Đường CV của atorvastatin và fenofibrat. Đường a) mẫu trắng, đường b) không có quá trình hấp phụ, đường c) có quá trình hấp phụ ở thế -0,25 V,
thời gian hấp phụ 30s)
Qua đường von-ampe vòng cho thấy, trên đường phân cực catot từ -0,25V đến -1,5V có hai píc xuất hiện ở thế -1,18V ứng với chất phân tích fenofibrat và - 1,32V ứng với atorvastatin.Trên đường phân cực anot không thấy xuất hiện píc nào,
a
b
c
Luận văn thạc sĩ Khoa học
37
điều đó cho thấy đặc tính điện hóa không thuận nghịch của fenofibrat và atorvastatin. Từ kết quả đo được cho thấy, cường độ dòng píc khi có hấp phụ cao hơn gấp 2 lần so với trường hợp không có hấp phụ. Như vậy, có thể khẳng định rằng atorvastatin và fenofibrat có hấp phụ trên điện cực giọt thủy ngân. Sự tách píc của 2 chất rõ ràng nên có thể định lượng đồng thời hỗn hợp 2 chất bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ
Cường độ dòng píc của atorvastatin tăng không đáng kể khi tiến hành đo dung dịch trong điều kiện có hấp phụ tại một thế xác định trong thời gian thích hợp, nguyên nhân có thể do nồng độ của atorvastatin quá lớn nên bề mặt điện cực bị bão hòa. Tuy nhiên, qua phần khảo sát đặc tính điện hóa của atovastatin thì atovastatin có hấp phụ trên điện cực HMDE.
Để khẳng định phản ứng điện hóa xảy ra trên bề mặt điện cực, chúng tôi đã ghi đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét. Các điều kiện đó được tiến hành ở hỗn hợp dung dịch atorvastatin 15.10-7 M + fenofibrat 5.10-7M, thời gian hấp phụ là 60s tại thế hấp phụ là -0,25V, thay đổi tốc độ quét từ 25mV/s đến 200mV/s.
Bảng 3.8. Cường độ dòng píc khi thay đổi tốc độ quét từ 25mV/s đến 200mV/s.
Tốc độ quét mV/s Ifenofibrate(nA) Iatorvastatin(nA)
25 6,47 4,9
50 14,1 9,79
75 23,1 14,8
100 31,6 19,0
150 47,9 26,5
200 66,9 35,0
Luận văn thạc sĩ Khoa học
38
-600m -800m -1.00 -1.20 -1.40
U (V) -400n
-300n -200n -100n 0 100n
I (A)
Hình 3.21: Đường von-ampe vòng của atorvastati và fenofibrat phụ thuộc vào tốc độ quét
Khi tốc độ quét (γ) thế tăng thì cường độ dòng pic hòa tan tăng tuyến tính theo phương trình: logIp = 1,12 logγ – 0,75, R2 = 0,9995 đối với fenofibrat và log Ip
= 0,94 logγ – 0,60R2 = 0,998 đối với atorvastatin. Hệ số góc của mối tương quan giữa log Ip và logγ là 1,12 với fenofibrat và 0,94 với atorvastatin. Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ atorvastatin và fenofibrat đều hấp phụ mạnh trên điện cực HMDE [14,15].
Píc khử hòa tan của atorvastatin và fenofibrat trên điện cực giọt thủy ngân treo xảy ra theo phương trình điện hóa:
Hình 3.22: Phản ứng điện hóa của atorvastatin
Luận văn thạc sĩ Khoa học
39
Hình 3.23: Phản ứng điện hóa của fenofibrat.
Khảo sát ảnh hưởng của pH.
pH ảnh hưởng đến đặc tính điện hóa của chất cũng như khả năng hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt điện cực HMDE. Vì vậy, việc chọn pH thích hợp là rất quan trọng. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng từ pH 5,0 đến 9,5 sử dụng đệm Britton-Robinson, nồng độ của fenofibrat là 5.10-7M và nồng độ atorvastatin là 15.10-7M, kết quả được trình bày trên bảng 3.9 và hình 3.24.
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng của píc
pH Ifenofibrate(nA) Iatorvastatin(nA)
6,0 11,50 6,04
6,5 13,00 6,58
7,0 17,03 8,05
7,5 6,55 13,43
8,0 3,60 13,30
8,5 4,99 11,87
9,0 1,89 13,20
Luận văn thạc sĩ Khoa học
40
Hình 3.24: Sựphụ thuộc của cường độ dòng píc vào pH
-900m -1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40
U (V) -150n
-125n -100n -75.0n -50.0n -25.0n 0
I (A)
Hình 3.25: Đường von-ampe hòa tan khi thay đổi pH từ 5,0 đến 9,0.
Qua kết quả thực nghiệm cho thấy tại pH = 5,0 đường von-ampe hòa tan không có tín hiệu, khi tiến hành đo ở pH = 6,0 thì đường von-ampe hòa tan chỉ ghi được píc khử của fenofbrat, không có píc khử của atorvastatin xuất hiện, điều này chứng tỏ khi pH < 6,0 thì atorvastatin tồn tại dạng axit không có hoạt tính điện hóa.
Khi pH = 6,5 thì píc khử của atorvastatin xuất hiện và tách riêng rẽ rất tốt với fenofibrat. Khi pH tiếp tục tăng lên thì cường độ dòng píc của atorvastatin tăng nhưng thế đỉnh pic dịch chuyển về phía dương hơn, trong khi đó thế đỉnh píc khử của fenofibrat dịch chuyển về phía âm. Do đó thế đỉnh píc khử của hai chất sát lại gần nhau. Vì vậy, bằng thực nghiệm chúng tôi chọn pH = 6,5, đây là môi trường thích hợp để phân tích đồng thời hai chất có mặt trong dung dịch đo.
pH=6,0 pH=6,5 pH=7,5
pH=8,5
pH=9,0
Luận văn thạc sĩ Khoa học
41 Khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ
Để nghiên cứu đặc tính hấp phụ của chất, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ với các điều kiện đo: nồng độ dung dịch chất phân tích gồm atorvastatin có nồng độ15.10-7M và fenofibrat có nồng độ 5.10-7M, tốc độ quét 15mV/s, thời gian hấp phụ 60s, thay đổi thế hấp phụ trong khoảng từ -0,1V đến - 1,0V. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng píc Ehp (V) Ifenofibrate(nA) Iatorvastatin(nA)
-0,1 26,30 54,71
-0,2 29,80 54,20
-0,4 29,70 54,20
-0,5 28,10 56,10
-0,6 25,80 55,10
-0,8 19,60 57,40
-0,9 22,60 54,80
-1,0 17,50 56,00
Hình 3.26: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thế hấp phụ.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
42
-900m -1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 U (V)
-60.0n -40.0n -20.0n 0
I (A)
Hình 3.27: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ
Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ thấy rằng, khi thay đổi thế hấp phụ từ -0,1 V đến - 1,0 V chỉ có giá trị cường độ dòng của fenofibrat thay đổi, còn atorvastatin không ảnh hưởng. Khi thế hấp phụ từ -0,3V đến -0,4 V thì cường độ dòng píc của fenofibrat cao nhất và ổn định. Do vậy, chúng tôi chọn thế hấp phụ là -0,4V
Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ
Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ, thời gian hấp phụ hay thời gian làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích, khi nồng độ chất phân tích nhỏ thì cần thời gian hấp phụ lâu hơn so với dung dịch có nồng độ chất phân tích lớn. Cho nên việc chọn thời gian hấp phụ phù hợp với nồng độ chất phân tích là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện (LOD) cũng như độ chọn lọc của phương pháp. Chính vì vậy mà chúng tôi đã tiến hành khảo sát thời gian hấp phụ ở nồng độ là 5.10-7M và với các điều kiện đo dung dịch đệm BR pH=6,5, thế hấp phụ -0,4V. Kết quả đo được trình bày trên hình 3.28, hình 3.29 và bảng 3.11:
-0,4V
Luận văn thạc sĩ Khoa học
43
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ tới cường độ dòng píc tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M.
t(s) I (nA)
Feno Ato
0 17,1 10,2
10 29,0 30,1
20 38,1 45,4
30 39,7 43,1
60 46,0 65,4
90 50,8 88,4
120 50,4 92,3
150 53,2 100,5
Hình 3.28: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M.
Luận văn thạc sĩ Khoa học
44
-900m -1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40
U (V) -100n
-80.0n -60.0n -40.0n -20.0n 0
I (A)
Hình 3.29: Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào thời gian hấp phụ tại nồng độ chất phân tích 5.10-7M.
Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ thấy rằng, khi tăng thời gian hấp phụ thì cường độ dòng píc tăng tương ứng. Tuy nhiên, khi tăng thời gian hấp phụ, cường độ dòng píc của atorvastatin tăng nhưng tín hiệu píc nhọn và có dấu hiệu chẻ píc khi thời gian hấp phụ lớn hơn 20s. Do vậy, để có thể phân tích được đồng thời được atorvastatin và fenofibrat chúng tôi chọn thời gian hấp phụ 10s.
Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế
Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ tốc độ quét thế ảnh hưởng nhiều đến cường độ dòng hòa tan hấp phụ. Khi tốc độ quét thế tăng thì cường độ dòng píc tăng, tuy nhiên khi tốc độ quét nhanh thì píc sẽ bị doãng ra, không cân đối và đỉnh píc nhọn. Đặc biệt với kỹ thuật quét thế xung vi phân thì tốc độ quét chậm hơn rất nhiều so với kĩ thuật quét sóng vuông. Để chọn được tốc độ quét thế phù hợp cho việc phân tích đồng thời atorvastatin và fenofibrat trong mẫu dược phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát trong các điều kiện: nồng độ chất đo là 5.10-7M, pH = 6,5, thế hấp phụ -0,4 V, thời gian hấp phụ10s, thời gian cân bằng 5s, tốc độ quét được thay đổi từ 0mV/s đến 100mV/s. Kết quả biểu diễn trên bảng 3.12 và hình 3.30:
10s
Luận văn thạc sĩ Khoa học
45
Bảng 3.12: Sự ảnh hưởng của tốc độ quét thế tới cường độ dòng píc.
γ (mv/s) I (nA)
Feno Ator
10 21,4 37,3
15 30,6 40,9
20 37,2 44,0
25 45,4 47,6
50 - -
100 - -
Qua kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế thấy rằng, khi tốc độ quét thế tăng từ 10 mV/s đến 25 mV/s thì cường độ dòng píc của atorvastatin và fenofibrat tăng. Khi tốc độ quét thế lớn hơn 50 mV/s thì cường độ dòng píc cao hơn nhưng píc bị biến dạng, sắc nhọn, không đo được cường độ dòng píc. Do vậy, chọn tốc độ quét là 15 mV/s.
-900m -1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40
U (V) -125n
-100n -75.0n -50.0n -25.0n 0
I (A)
Hình 3.30. Đường von-ampe hòa tan phụ thuộc vào tốc độ quét thế.
15mv/s
Luận văn thạc sĩ Khoa học
46
Sau khi khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định hỗn hợp atorvastatin và fenofibrat bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ, chúng tôi đã lựa chọn được các điều kiện như sau:
Dung dịch đệm Britton - Robinson với pH = 6,5, thế hấp phụ là -0,4V, thời gian hấp phụ là 10s với hỗn hợp dung dịch fenofibrat nồng độ 5.10-7 M, atovastatin nồng độ 15.10-7, thời gian cân bằng là 5s, tốc độ quét là 15 mV/s.