Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.3. Dung môi, hóa chất
Bảng 2.4: Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm.
STT Tên dung môi, hóa chất
Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Kali dihydrophosphat Merck Tinh khiết phân tích
2 Methanol Merck Dùng cho HPLC
3 Acetonitril Merck Dùng cho HPLC
4 Nước cất Viện Kiểm nghiệm
thuốc Trung Ƣơng
Dùng cho HPLC
5 Acid phosphoric Scharlau Tinh khiết phân tích
2.1.4. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC 20A sử dụng phần mềm LabSolution Ver 1.25.
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity DAD sử dụng phần mềm OpenLAB CDS ChemStation Workstation VL.
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Agilent 8453.
- Cân phân tích Mettler Toledo AG245.
- Cân kỹ thuật Mettler PE 1600.
- Bể lắc siêu âm PowerSonic 410.
- Máy ly tâm Eppendorf 5804.
- Bộ lọc hút chân không.
- Dụng cụ: các loại pipet, bình định mức, xylanh, cốc có mỏ, màng lọc mẫu 0,45 àm, cỏc lọ tiờm mẫu (vial) …
21 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
- Lựa chọn dung môi pha mẫu: thông dụng, rẻ tiền.
- Lựa chọn phương pháp xử lý: siêu âm, lắc cơ học, ly tâm…
2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích đồng thời AML, HCT và VAL, bao gồm:
- Pha tĩnh: Lựa chọn cột sắc ký có khả năng tách tốt và chọn lọc
- Pha động: Lựa chọn thành phần, tỷ lệ, pH và tốc độ dòng pha động cho thời gian lưu của chất phân tích vừa phải, tách tốt, sắc ký đồ đẹp.
- Detector và bước sóng phát hiện: chọn bước sóng tại đó đáp ứng phân tích của AML, HCT và VAL là tối ƣu.
2.2.3. Thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát để đảm bảo phương pháp nghiên cứu là phù hợp.
- Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
- Tính chọn lọc của phương pháp (Độ đặc hiệu).
- Độ tuyến tính.
- Độ chính xác: gồm độ lặp lại và độ tái lặp.
- Độ đúng của phương pháp.
- Độ thô.
2.2.4. Ứng dụng phương pháp phân tích một số chế phẩm trên thị trường - Thu thập một số chế phẩm chứa 2 hoặc 3 thành phần.
- Tiến hành phân tích các thành phần trong chế phẩm theo phương pháp đã xây dựng.
22 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên lý phân tích: Mẫu được nghiền mịn, xử lý mẫu bằng phương pháp thích hợp, lọc qua màng lọc 0,45 μm, tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, ghi lại sắc ký đồ.
Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu: Đưa ra một quy trình phân tích bằng sắc ký lỏng pha đảo (Rp-HPLC) đơn giản, thiết bị phù hợp với đa số các phòng thử nghiệm trong hệ thống kiểm nghiệm: dung môi phân tích thông dụng, dễ kiếm, ít độc hại; detector UV-VIS thông dụng; cách xử lý mẫu đơn giản, dễ tiến hành.
Các số liệu đề tài thu thập từ kết quả thực nghiệm ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời Amlodipin besylat, Hydroclorothiazid và Valsartan.
2.3.1.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp:
Nhận thấy AML, HCT và VAL đều là các chất có độ phân cực tốt, do đó chúng tôi tiến hành khảo sát hệ sắc ký lỏng pha đảo với pha tĩnh ít phân cực (cột C18) và hệ pha động phân cực để phân tích các chất.
Nguyên tắc của việc lựa chọn điều kiện sắc ký là lựa chọn đƣợc loại cột sắc ký, loại pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện đảm bảo các chất tách nhau rõ rệt, píc gọn, cân đối, thời gian phân tích phù hợp, đáp ứng phân tích là tối ƣu cho ba hoạt chất.
- Lựa chọn cột sắc ký: khảo sát các loại cột có kích cỡ hạt khác nhau và của các hãng sản xuất khác nhau.
- Lựa chọn pha động: Tham khảo các tài liệu, chúng tôi khảo sát trên dung môi pha động gồm ACN, MeOH và dung dịch đệm KH2PO4 0,05M (pH 3,0) với các tỷ lệ khác nhau.
23
- Lựa chọn bước sóng: Tiến hành quét phổ hấp thụ UV của AML, HCT và VAL để lựa chọn bước sóng tối ưu trong phân tích.
2.3.1.2. Thẩm định phương pháp phân tích
Xử lý mẫu theo phương pháp đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: tính chọn lọc (độ đặc hiệu của phương pháp), độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, tính thích hợp hệ thống và độ thô.
* Tính thích hợp của hệ thống [6], [7], [17]:
- Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần lien tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích píc của các lần sắc ký
- Yêu cầu: + Số đĩa lý thuyết ≥ 3000.
+ Hệ số bất đối: 0,8 – 1,5.
+ Hệ số phân giải ≥ 2,0.
+ Chênh lệch diện tích píc, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2,0 %.
* Độ đặc hiệu của phương pháp [6], [7], [17]:
- Tạo mẫu placebo tự tạo với các thành phần tá dược tương tự như trong chế phẩm nhƣng không có hoạt chất AML, HCT và VAL. Chuẩn bị mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu thử, mẫu placebo. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký với các điều kiện nhƣ mẫu thử.
- Dựa vào đặc tính của detector DAD, tiến hành quét và chồng phổ UV- VIS của từng hoạt chất trong mẫu chuẩn hỗn hợp và mẫu thử, tính hệ số Match.
- Tính hệ số tinh khiết píc của các hoạt chất trong mẫu thử.
24
- Yêu cầu: + Trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu đƣợc, tại thời điểm tương ứng píc của AML, HCT và VAL không được xuất hiện píc lạ.
+ Hệ số chồng phổ UV-VIS phải xấp xỉ 1,0.
+ Hệ số tinh khiết píc của các hoạt chất phải xấp xỉ 1,0.
* Độ tuyến tính [6], [7], [17]:
- Tiến hành xác lập mối tương quan giữa diện tích píc đáp ứng với nồng độ của AML, HCT và VAL. Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ AML, HCT và VAL tăng dần. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và xác định hệ số tương quan hồi quy r
- Yêu cầu: Phương trình hồi quy là dạng bậc 1 và giá trị r ≥ 0,999.
* Độ chính xác: thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định [6], [7], [17].
- Độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn.
Tiến hành thí nghiệm 6 mẫu thử song song trên cùng một mẫu chế phẩm (cùng nồng độ 100%), tính hàm lƣợng lần lƣợt của AML, HCT và VAL trong mẫu thử. Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD.
Yêu cầu: RSD của 6 kết quả ≤ 2,0 %.
- Độ tái lặp: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của phương pháp nhƣng tiến hành vào thời gian và với phòng thí nghiệm khác. Đánh giá kết quả lặp lại trong ngày qua giá trị RSD và đánh giá độ chính xác của phương pháp qua phân tích t-test Microsoft office Excel 2007.
Yêu cầu: + RSD của 6 kết quả ≤ 2,0 %.
+ RSD của 12 kết quả ≤ 2,0 %.
25
+ Hàm lƣợng trung bình giữa 2 phòng thí nghiệm ≤ 2,0 %.
+ ttn < ttc (p-value > 0,05).
* Độ đúng [6], [7], [17]:
- Xác định độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo. Lượng chất chuẩn thêm vào để thu được nồng độ tương ứng với khoảng 50 %, 100 % và 200 % nồng độ định lƣợng. Ở mỗi mức tiến hành với 3 lần thử riêng biệt.
- Tính tỉ lệ thu hồi của AML, HCT và VAL chuẩn thêm vào mẫu thử.
- Yêu cầu: + Tỉ lệ thu hồi đạt 98,0 % - 102,0 % + Giá trị RSD ≤ 2,0 %.
* Độ thô của phương pháp là khả năng của quy trình phân tích cho các kết quả có độ chính xác và độ đúng chấp nhận được dưới những điều kiện có sự thay đổi nhỏ về độ ổn định của các dung dịch phân tích, trị số pH, nhiệt độ, thành phần của hệ dung môi sắc ký, cột sắc ký do các nhà cung cấp khác nhau.... [6], [7], [17].
- Tiến hành xác định hàm lượng mẫu thử dưới các điều kiện có sự thay đổi nhỏ nhƣ sau:
+ Thay đổi chiều dài cột.
+ Thay đổi pH dung dịch đệm: trong khoảng ± 0,2.
+ Thay đổi tỉ lệ pha động: trong khoảng ± 30% nồng độ tương đối (hoặc 2% nồng độ tuyệt đối) đối với thành phần dung môi có tỉ lệ nhỏ (tùy theo giá trị nào lớn hơn).
+ Thay đổi tốc độ dòng: trong khoảng ± 50%.
- Đánh giá độ thô qua phân tích thống kê ANOVA trên Microsoft office Excel 2007.
- Yêu cầu: Ftn < Ftc (p-value > 0,05)
26
2.3.2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số chế phẩm trên thị trường Ứng dụng phương pháp phân tích đã lựa chọn để định lượng các chế phẩm: Viên nén bao phim Exforge HCT, viên nén Exforge, viên nén Co- diovan, viên nén Normodipine.
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
* Một số đặc trƣng thống kê: Các đặc trƣng thống kê đƣợc tính dựa vào dựa vào các hàm số trong Microsoft office Excel 2007.
Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) = %
* Tương quan hồi quy tuyến tính:
Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích: Y = aX +b
Hệ số góc a: Hàm SLOPE
Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT Hệ số tương quan r: Hàm CORREL
* Phân tích ANOVA để đánh giá độ thô của phương pháp.
* Phân tích t-test để đánh giá độ chính xác của phương pháp.
27
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. CHUẨN BỊ MẪU
3.1.1. Mẫu chuẩn
3.1.1.1. Pha dung dịch chuẩn gốc AML
Cân chính xác khoảng 43,45 mg chuẩn AML vào bình định mức 50 ml.
Hòa tan và pha loãng bằng MeOH vừa đủ thể tích, lắc đều. Đƣợc dung dịch chuẩn gốc AML có nồng độ 0,625 mg/ml.
3.1.1.2. Pha dung dịch chuẩn gốc HCT
Cân chính xác khoảng 39,24 mg chuẩn HCT vào bình định mức 50 ml.
Hòa tan và pha loãng bằng MeOH vừa đủ thể tích, lắc đều. Đƣợc dung dịch chuẩn gốc HCT có nồng độ 0,78125 mg/ml.
3.1.1.3. Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc
Cân chính xác khoảng 50,1 mg chuẩn VAL vào bình định mức 25 ml.
Thêm chính xác 5 ml dung dịch chuẩn gốc AML và 5 ml dung dịch chuẩn gốc HCT vào bình định mức trên, hòa tan và pha loãng bằng MeOH vừa đủ thể tích, lắc đều. Đƣợc dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc có nồng độ AML, HCT và VAL tương ứng là 0,125 mg/ml 0,1562 mg/ml và 2 mg/ml.
3.1.2. Mẫu thử
Cân chính xác 20 viên nén bao phim Exforge HCT, tính khối lƣợng trung bình viên. Nghiền mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 100 mg VAL cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu âm trong 15 phút. Thêm MeOH đến vạch, lắc đều. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút. Hút chính xác 2 ml dịch trong ở trên cho vào bình định mức 25 ml, pha loãng bằng pha động đến vừa đủ thể tích. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm.
28 3.1.3. Mẫu placebo tự tạo
Trộn đều các thành phần tá dƣợc. Nghiền mịn. Cân chính xác một lượng tương ứng khoảng 134,5 mg cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu âm trong 15 phút. Thêm MeOH đến vạch, lắc đều.
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút. Hút chính xác 2 ml dịch trong ở trên cho vào bình định mức 25 ml, pha loãng bằng pha động đến vừa đủ thể tích. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm.
3.2. LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 3.2.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu
Dung môi pha mẫu cần hòa tan tốt dƣợc chất, nhanh chóng và đảm bảo độ ổn định của dƣợc chất trong thời gian phân tích.
AML, HCT và VAL đều có độ phân cực tốt, do đó chúng tôi tiến hành pha chuẩn AML, chuẩn HCT và chuẩn VAL trong các dung môi: ACN, MeOH. Kết quả nhận thấy các chất tan tốt trong cả hai loại dung môi. Tuy nhiên, MeOH là dung môi thông dụng và rẻ tiền hơn ACN, do đó chúng tôi đã lựa chọn MeOH làm dung môi pha mẫu.
3.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu và điều kiện sẵn có pha tĩnh, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký về cột sắc ký; thành phần, tỉ lệ pha động và bước sóng phát hiện sao cho píc của ba hoạt chất được tách riêng, píc đẹp, đồng thời có thời gian phân tích phù hợp.
3.2.2.1. Bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ hấp thụ UV các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ AML, HCT và VAL trong pha động tương ứng lần lượt là 0,01 mg/ml;
29
0,0125 mg/ml và 0,16 mg/ml trong khoảng 200 – 300 nm. Kết quả đƣợc thực hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5: Phổ hấp thụ UV của các chất
Kết quả cho thấy cực đại hấp thụ của AML là 238 nm, còn HCT có 2 cực đại hấp thụ là 222 nm và 271 nm, VAL thì nồng độ quá lớn không có cực đại hấp thụ đặc trƣng. Trong các chế phẩm 3 thành phần, hàm lƣợng AML thường nhỏ hơn HCT nên ưu tiên sử dụng bước sóng tối ưu cho AML. Ngoài ra, ở bước sóng 238 nm sẽ tránh ảnh hưởng của các thành phần dung môi có trong pha động. Do đó, chúng tôi lựa chọn bước sóng phân tích trong nghiên cứu là 238 nm.
3.2.2.2. Pha động
Qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi bước đầu lựa chọn pha động gồm 3 thành phần chính: MeOH, ACN và dung dịch đệm KH2PO4 0,05M pH 3,0 (Đệm KH2PO4).
Đệm KH2PO4 đƣợc pha nhƣ sau: Cân 6,8 g KH2PO4 hòa tan trong 1 lít nước, điều chỉnh về pH 3,0 ± 0,05 bằng H3PO4 đặc.
Để lựa chọn đƣợc hệ pha động phù hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát lần lƣợt cỏc hệ sắc ký: sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 àm); tốc độ dũng 1,0 ml; bước súng 238nm; thể tớch tiờm 20 àl; tiến hành ở nhiệt độ thường và tỷ lệ 3 thành phần ACN : MeOH : Đệm KH2PO4 trong pha động đƣợc thay
30
đổi lần lƣợt là (10:50:40), (20:40:40), (30:30:40), (40:20:40), (25:40:35), (30:35:35), (35:30:35), (40:25:35), (20:50:30), (30:40:30), (40:30:30), (50:20:30). Kết quả thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Khảo sát tỷ lệ pha động
STT Tỷ lệ % thể tích Kết quả
ACN MeOH Đệm KH2PO4
1 10 50 40
Số đĩa lý thuyết của HCT < 3000.
Thời gian phân tích dài (trên 15 phút).
2 20 40 40
3 30 30 40
4 40 20 40 Số đĩa lý thuyết của HCT < 3000.
Hệ số bất đối của HCT > 1,5.
5 25 40 35 Số đĩa lý thuyết của HCT < 3000.
6 30 35 35 Pic đẹp, cân đối, các píc tách nhau rõ.
Thời gian phân tích khoảng 11 phút.
Độ phân giải lần lƣợt là 7,6 và 13,4.
7 35 30 35 Số đĩa lý thuyết của HCT < 3000.
Hệ số bất đối của HCT > 1,5.
8 40 25 35 Số đĩa lý thuyết của HCT < 3000.
9 20 50 30 Pic đẹp, cân đối, các píc tách nhau rõ.
Thời gian phân tích khoảng 9 phút.
Độ phân giải lần lƣợt là 8,2 và 7,1.
Áp suất cột vừa phải 126 bar 10 30 40 30 Pic đẹp, cân đối, các píc tách nhau rõ.
31
Thời gian phân tích khoảng 9 phút.
Độ phân giải lần lƣợt là 6,0 và 9,1.
11 40 30 30 Số đĩa lý thuyết của HCT < 3000.
Hệ số bất đối của HCT > 1,5.
12 50 20 30 Độ phân giải píc AML và HCT < 1.
Số đĩa lý thuyết của HCT < 3000.
Qua khảo sát tỷ lệ pha động, chúng tôi nhận thấy với 1 tỷ lệ dung môi hữu cơ nhất định, khi tăng dần tỷ lệ ACN thì píc HCT bị mất dần sự cân đối, khi tỷ lệ ACN lớn hơn tỷ lệ MeOH thì hệ số bất đối của píc HCT đều lớn hơn 1,5. Mặt khác, ở phần trên chúng tôi đã lựa chọn MeOH làm dung môi pha mẫu nên sẽ ƣu tiên lựa chọn pha động có tỷ lệ MeOH lớn hơn ACN và thỏa mãn các thông số (thời gian phân tích phù hợp, píc đẹp và cân đối). Do đó chúng tôi lựa chọn pha động với tỷ lệ ACN : MeOH : Đệm KH2PO4 = 20 : 50 : 30 cho quy trình phân tích này.
3.2.2.3. Cột sắc ký
Tiến hành khảo sát trên hệ sắc ký pha đảo với cột C18 gồm:
a. Khảo sát cỡ hạt
Dựa trên các điều kiện sẵn có tại phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sỏt trờn cỏc cột C18 mới đƣa vào sử dụng cú cỡ hạt là 5 àm và 10 àm;
tiến hành ở nhiệt độ thường; pha động có tỷ lệ ACN : MeOH : Đệm KH2PO4
= 20 : 50 : 30; tốc độ dũng 1,0 ml/ml; bước súng 238 nm, thể tớch tiờm 20 àl, bao gồm:
- Cột LichroCART C18 (250 x 4,0 mm; 10 àm) - Cột Agilent C18 (200 x 4,6 mm; 10 àm) - Cột Agilent C18 (250 x 4,6 mm; 5 àm)
32
Kết quả cho thấy khi sử dụng cột hạt 10 àm, trờn sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp chỉ cho 2 pớc, khi sử dụng cột hạt 5 àm, khả năng tỏch tốt hơn nên trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp cho 3 píc tách nhau hoàn toàn và rõ rệt, kết quả thể hiện ở hình 3.6. Do đó chúng tôi lựa chọn loại cột C18 có cỡ hạt 5 àm để khảo sỏt thờm.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min
-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400
mAU 238nm,4nm (1.00)
(a). Cột LichroCART hạt 10 àm
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min
-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
mAU 238nm,4nm (1.00)
(b). Cột Agilent hạt 10 àm
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min
0 100 200 300 400 500 600mAU
238nm,4nm (1.00)
(c). Cột Agilent hạt 5 àm
Hình 3.6: Sắc ký đồ khảo sát cỡ hạt sắc ký b. Khảo sát các loại cột
Với các điều kiện sắc ký nhƣ trên mục (a), tiến hành khảo sát các cột C18 cú cỡ hạt 5 àm của cỏc hóng sản xuất khỏc nhau và đều là cỏc cột mới đƣa vào sử dụng, bao gồm:
- Cột LichroCART C18 (250 x 4,0 mm; 5 àm) - Cột Agilent C18 (250 x 4,6 mm; 5 àm)