KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu 1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi
3.2.3. Phát hiện V. cholerae bằng kỹ thuật nuôi cấy
Quá trình nhận biết khuẩn lạc và xác định rõ vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy là rất cần thiết, kết quả nghiên cứu thể hiện ( Bảng 3.7 )
Bảng 3.7. Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi khuẩn
Các loại vi sinh vật Nuôi cấy
Số mẫu (+) / 270 mẫu Tỷ lệ (%)
V. cholerae O1 16 5,92
E. coli 47 17,40
N.A.G 4 1,49
Nghiên cứu của tác giả Đinh Sỹ Hiển và cộng sự tại 25 xã của huyện Từ Liêm, Hà Nội với 2.601 mẫu trong 5 năm cho thấy tỷ lệ dương tính của các loại vi khuẩn gây tiêu chảy là 11,54% [11]. Phải chăng V. cholerae xuất hiện khi các căn nguyên khác phát triển hay V. cholerae là yếu tố mồi từ đó xuất hiện các căn nguyên khác.
Nghiên cứu của Lê Lan Hương và cộng sự (1995) đã nghiên cứu trên 121 mẫu phân bệnh nhân có 32 mẫu dương tính với một số vi khuẩn gây tiêu chảy (V.cholerae O1 , Shigella, Salmonella, E. coli ) chiếm tỷ lệ 26,45 % [15], kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Thế Trâm và cộng sự (1985) tại phường Vĩnh Phước, Nha Trang cho thấy tỷ lệ dương tính đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy là 11,34% [42].
Còn tại các bệnh viện có ổ dịch ở khu vực 5 tỉnh Duyên Hải miền Trung qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thế Trâm, Nguyễn Thị Kê với 5.171 mẫu thu thập cho thấy tỷ lệ dương tính với 4 tác nhân gây bệnh là 24,34% (V. cholerae O1, Shigella, Salmonella, Echerichia coli ) [42].
Đánh giá nghiên cứu của chúng tôi về phân lập các loại vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mẫu phân ở bệnh nhân tiêu chảy cấp nghi mắc tả trên 270 mẫu bệnh phẩm cho thấy đối với chủng V. cholerae O1 có 16 mẫu dương tính, với vi khuẩn E. coli có 47 mẫu dương tính, các phẩy khuẩn không phải vi khuẩn tả (N.A.G) có 4 mẫu, trong nghiên cứu chúng tôi các vi khuẩn gây tiêu chảy có tỷ lệ phát hiện dương tính tương đương với các công bố của các tác giả khác. Ngoài ra có một số loaị vi khuẩn khác nhưng vì điều kiện và thời gian ngắn nên chúng tôi chưa đánh giá hết được.
Bảng 3.8. Tỷ lệ V. cholerae O1 dương tính bằng kỹ thuật nuôi cấy
Kết quả Nuôi cấy Tỷ lệ %
Âm tính 254 94,07
Dương tính 16 5,93
Tổng 270 100
Tỷ lệ V. cholerae O1 phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả 16 mẫu dương tính trên 270 mẫu chiếm tỷ lệ 5,93% ( Bảng 3.8; biểu đồ 3.6 ), kỹ thuật này cho kết quả rất chính xác nhưng phải qua nhiều bước khác nhau, đặc biệt phải có phòng xét nghiệm vi sinh hợp lý đúng tiêu chuẩn, đủ môi trường nuôi cấy, cán bộ xét nghiệm phải có kinh nghiệm phán đoán để có các hướng cấy chuyển cần thiết tiếp theo, khâu cuối cùng của kỹ thuật là khẳng định bằng ngưng kết kháng huyết thanh đa giá, đơn giá trước khi kết luận.
Tỷ lệ phát hiện dương tính V.cholerae O1bằng kỹ thuật nuôi cấy 5.93%
94.07%
Âm tính Dương tính
Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ dương tính V. cholerae bằng kỹ thuật nuôi cấy
Phương pháp nuôi cấy được coi là " tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn còn mặt hạn chế đó là thời gian trả lời kết quả khẳng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và không phát hiện được V. cholerae khi bệnh nhân đã dùng kháng sinh.
Kỹ thuật nuôi cấy đã chọn lọc được khuẩn lạc thuần khiết và đặc hiệu ngoài kinh nghiệm của cán bộ xét nghiệm thì yếu tố môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng, môi trường phải đảm bảo chất lượng. Trên môi trường thạch kiềm rất tốt cho sự phát triển của V. cholerae nhưng ngược lại các loại vi khuẩn khác lại không phù hợp do vậy tính chất môi trường nuôi cấy phải có tính chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại tốt với loại vi khuẩn khác.
Môi trường thạch TCBS ( Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) là môi trường chọn lọc tốt nhất để phân lập V. cholerae và được dùng rộng rãi trên thị trường, môi trường đã được thương mại hoá đông khô nên dễ pha chế, môi trường có màu xanh sau khi pha chế nhưng chỉ lưu giữ được một thời gian ngắn (3 - 5 ngày ) những khuẩn lạc mọc trên môi trường này không thích hợp cho phản ứng ngưng kết với phản ứng kháng huyết thanh, khuẩn lạc nghi ngờ mọc sau 12 giờ có khuẩn lạc tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng do lên men đường
saccharose, những vi khuẩn không lên men saccharose có khuẩn lạc màu xanh lơ có thể là V. parahaemolyticus, khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae cần phải cấy trên các môi trường ít chất ức chế như thạch thường, môi trường KIA.
Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trên môi trường TCBS để xác định các tính chất sinh hoá, các tính chất sinh hoá rất quan trọng để phát hiện và phân biệt V. cholerae.
Bảng 3.9. Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường TCBS
Kích thước khuẩn lạc
Màu sắc khuẩn
lạc n Tỷ lệ %
nhỏ 2-3 mm vàng, bóng 67 24,81 nhỏ 1-3 mm không màu 203 75,19
Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả 67 mẫu có khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS chiếm tỷ lệ 24,81 % ( Bảng 3.9 ). Môi trường TCBS ( Hình 3.7 ) là môi trường chọn lọc rất tốt trong việc phân lập V. cholerae tuy nhiên khuẩn lạc này không trực tiếp thực hiện phản ứng Oxidase tiếp theo.
Hình 3.7. Hình ảnh khuẩn lạc V. parahemoliticus và V. cholerae O1
Hình 3.8. Khuẩn lạc V. cholerae trên môi trường thạch kiềm
* Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm: Là môi trường thạch thường nhưng có pH kiềm ( pH = 9 ) thích hợp cho V. cholerae phát triển, khuẩn lạc V. cholerae nhỏ, tròn, trong, long lanh như hạt sương, có thể dùng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase.
Bảng 3.10. Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm
Kích thước Màu sắc khuẩn n Tỷ lệ
khuẩn lạc lạc %
nhỏ 1-3 mm Nhỏ, trong, không màu.
62 22,96
nhỏ 1-3 mm Đục, hoặc có các màu khác nhau
218 80,74
Tính chất khuẩn lạc trên môi trường thạch kiềm ( Hình 3.8 ) cho thấy môi trường thạch kiềm thích hợp cho V. cholerae O1 phát triển, khuẩn lạc nhỏ, tròn, trong, long lanh như hạt sương, có thể dùng khuẩn lạc này để ngưng kết phản ứng Oxidase nên khi tiến hành nghiên cứu chúng tôi cấy cả 2 loại môi trường kết hợp là TCBS và thạch kiềm và luôn ưu tiên cấy trên thạch kiềm nhiều hơn vì môi trường này V. cholerae O1 mọc nhanh hơn từ 6-24h đã mọc khuẩn lạc và khuẩn lạc này được dùng để thực hiện phản ứng Oxidase và các bước tiếp theo. Trong khi đó trên môi trường TCBS thời gian mọc khuẩn lạc muộn hơn so khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch kiềm, nhưng khi mọc đã bổ sung cho nhau về ưu điểm của mỗi loại môi trường, trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho 62 mẫu quan sát khuẩn lạc nhỏ trong không màu chiếm tỷ lệ 22,96 % ( Bảng 3.10 )
* Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trường nuôi cấy
Thời gian mọc khuẩn lạc đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy chẩn đoán nhanh V. cholerae O1. Như đã đề cập trong phần tổng quan, nếu có điều kiện nên cấy trên cả 2 loại môi trường là TCBS và thạch kiềm, đặc biệt trên
môi trường thạch kiềm sau 6 giờ khuẩn lạc đã mọc sẽ được dùng trong phản ứng Oxidase và ngưng kết kháng huyết thanh.
Bảng 3.11. Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trường nuôi cấy
Theo dõi thời gian mọc khuẩn lạc trên môi trường TCBS và môi trường thạch kiềm chúng tôi nhận thấy trên môi trường thạch kiềm khuẩn lạc mọc 6 giờ sau khi cấy có 21 mẫu mọc chiếm tỷ lệ 7,78 % trong khi đó trên môi trường TCBS chưa có khuẩn lạc nào mọc ( Bảng 3.11 ). Trong phần phương pháp nghiên cứu chúng tôi đã đề cập với thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 môi trường không giống nhau nhưng có ý nghĩa rất quan trọng cho việc khảng định tính chất sinh hóa sau này.
Khuẩn lạc nghi ngờ là V. cholerae được định hướng dựa vào tính chất sinh vật hóa học để phân biệt được các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột bằng cách chọn những khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae trên môi trường TCBS để xác định các tính chất sinh hoá. Các tính chất sinh hoá rất quan trọng để phát hiện và phân biệt các loài V. cholerae, đánh giá tính chất sinh vật hóa học chúng tôi chọn 31 mẫu có phản ứng Oxidase dương tính để thực hiện nuôi cấy tiếp trên môi trường sinh vật hóa học.
Môi trường Thời gian mọc khuẩn lạc
n Tỷ lệ
%
Môi trường TCBS < 6h 0/270 0
Môi trường thạch kiềm < 6h 21/270 7,78
Hình 3.9. Các môi trường sinh vật hóa học trong chẩn đoán V. cholerae Bảng 3.12. Bảng đọc kết quả trên môi trường sinh vật hoá học
Kết quả thực hiện trên môi trường sinh vật hóa học với 24 mẫu glucoza dương tính, 21 mẫu âm tính đường lactoza, trên môi trường ma nit có 27 mẫu dương tính và 23 mẫu quan sát đường cấy thấy di động, môi trường Indol có 2 mẫu dương tính, đặc biệt trong 3 loại đường thì Arabinoza có 21 mẫu âm tính, mannoza có 20 mẫu dương tính, saccaroza có 20 mẫu dương tính (Bảng 3.12 )
Tính chất sinh vật hóa học có thể phân biệt được các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột, tuy nhiên để rút ngắn quá trình chẩn đoán ta cần
STT Sinh vật hóa học
Tiêu chuẩn đánh giá dương tính
Kết quả
1 Oxidaza + 31
2 Glucoza / H2S + / + 24 / 23
3 Lactoza - 21
4 Manit + 27
5 Di động + 23
6 urê - 22
7 Indol + 21
8 Arabinoza - 21
9 Mannoza + 20
10 Saccaroza + 21
dùng một số đặc điểm chính để phân biệt (loại trừ ngay các vi khuẩn âm tính với oxidase ).
* Nhận biết phản ứng dương tính Oxidase
Khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc được dùng để thực hiện phản ứng Oxidase, đây là phản ứng rất quan trọng để phân biệt V. cholerae với các vi khuẩn đường ruột khác, V. cholerae có phản ứng oxidase (+). Cách tiến hành đơn giản khi có khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch kiềm bằng cách nhỏ một giọt dung dịch Oxidase lên mảnh giấy lọc, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn đều trên giấy lọc đã thấm thuốc thử, quan sát sự đổi màu trong vài phút, có thể coi phản ứng Oxidase như chìa khóa để chẩn đoán vi khuẩn tả vì nếu âm tính thì sẽ loại tìm theo hướng khác, nếu phản ứng dương tính sẽ thực hiện các bước để chẩn đoán vi khuẩn tả.
Để rút ngắn quá trình chẩn đoán chúng tôi đã thực hiện một số đặc điểm chính để phân biệt bằng thử phản ứng Oxidase bằng cách nhỏ một giọt dung dịch Oxidase lên mảnh giấy lọc, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn đều trên giấy lọc đã thấm thuốc thử, quan sát sự đổi màu trong vài phút kết quả thể hiện ở ( Hình 3.10 )
Bảng 3.13. Phản ứng Oxidase
Kết quả Oxidase Tỷ lệ %
Dương tính 31 11,48
Âm tính 239 88,52
Tổng cộng 270 100
V. cholerae có phản ứng Oxidase (+), không nên lấy khuẩn lạc trực tiếp từ môi trường TCBS để làm phản ứng Oxydase từ đó có thể cho kết quả không chính xác mà nên cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường TCBS sang môi trường không chọn lọc như thạch thường hoặc thạch máu rồi từ đó tiếp tục làm phản ứng Oxidase.
Kết quả nghiên cứu chúng tôi cho thấy có 31 mẫu dương tính với phản ứng Oxidase chiếm tỷ lệ 11,48 % ( Bảng 3.13), nếu so kỹ thuật soi tươi phát hiện mẫu nghi ngờ dương tính V. cholerae O1 là 28 mẫu chiếm tỷ lệ 10,37 %. Vấn đề đặt ra trong thực tế nếu các phòng thí nghiệm chưa hoàn chỉnh để thực hiện các bước nuôi cấy thì có thể áp dụng cấy bệnh phẩm từ môi trường tăng sinh vào môi trường thạch kiềm sau 6 giờ ta có thể chọn khuẩn lạc thực hiện phản ứng Oxidase.
Hình 3.10. Hình ảnh phản ứng Oxidase
* Nhận biết vi khuẩn mọc trên môi trường pepton kiềm
Môi trường pepton kiềm được dùng để vận chuyển V. cholerae trong một thời gian ngắn nếu không có môi trường Carry – Blair. Không thể dùng được lâu nếu việc vận chuyển chậm quá 6 giờ vì các vi khuẩn khác như Pseudomonas sẽ mọc lấn át V. cholerae. Pepton kiềm mặn là môi trường tăng
sinh nên được cấy chuyển liên tiếp 3 lần, mỗi lần 3 giờ ở nhiệt độ 370C. Đây là môi trường tăng sinh tốt nhất cho sự phát triển V. cholerae, vì vi khuẩn này mọc rất nhanh trong pepton kiềm do pH của nó rất thích hợp (pH 8,4-9,2).
Khi xét nghiệm mẫu thực phẩm hoặc mẫu nước tìm V. cholerae trong vụ dịch tả người ta thường dùng hai bước tăng sinh bằng pepton kiềm, bước tăng sinh thứ hai nhằm loại bớt các tạp khuẩn, hơn nữa người ta còn dùng môi trường Monsur tellurit-taurocholat để tăng sinh vì môi trường này có nhiều chất ức chế hơn.
Theo dõi tính chất mọc của V. cholerae trên môi trường pepton kiềm (môi trường tăng sinh) chúng tôi có một số nhận xét về tính chất mọc váng của V. cholerae trên môi trường pepton kiềm mặn là môi trường tăng sinh có ý nghĩa quan trọng trong các bước của quá trình nuôi cấy vì nếu trong mẫu bệnh phẩm có ít vi khuẩn tả như một số mẫu thực phẩm thì việc cấy môi trường tăng sinh càng đóng vai trò quyết định nếu không sẽ không bao giờ phân lập được vi khuẩn tả trong nước, thực phẩm, là môi trường có độ kiềm cao pH = 8,5 và lượng muối mặn đến 30g trên một lít môi trường, nên khi cấy ở 2-3 giờ đầu các vi khuẩn khác bị ức chế chưa mọc được thì vi khuẩn tả mọc lấn át, do vậy nuôi cấy trên môi trường này có ý nghĩa làm tăng sinh lượng vi khuẩn lên nhiều mặt khác làm thuần khiết đồng nhất khuẩn lạc. Nếu bị nhiễm khuẩn trong quá trình lấy mẫu hoặc nuôi cấy bị nhiễm cũng như bệnh nhân đã điều trị bằng kháng sinh phải sau 3 lần cấy chuyển mỗi lần 3 giờ lúc đó mới có thể phân lập được vi khuẩn tả.
Trong nhiều mẫu phân có mật độ vi khuẩn cao ( 107-108/ml phân ) việc tăng sinh là không cần thiết. Canh thang giàu dinh dưỡng thường được sử dụng để phục hồi vi khuẩn, nước pepton kiềm thường được sử dụng nhất, pH của canh thang từ 8,4 - 9,2 thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. V. cholerae là vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC, phát triển tốt trong môi trường kiềm có độ pH 8,5 - 9,5 và nồng độ muối đến 15%.
Bảng 3.14. Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường pepton kiềm
Môi trường tăng sinh
Môi trường thạch kiềm 1
Môi trường thạch kiềm 2
Môi trường
thạch kiềm 3 Kết luận
Pepton 1 8 8
Pepton 2 0 6 6
Pepton 3 0 0 2 2
Tổng cộng 16
Kết quả nghiên cứu chúng tôi nhận thấy nếu bệnh nhân nào mới vào viện chưa điều trị kháng sinh thì việc nuôi cấy phân lập rất dễ và trả lời kết quả nhanh hơn nhiều so với các bệnh nhân đã điều trị thuốc kháng sinh.
Qua theo dõi phiếu điều tra và kết quả phân lập trên môi trường pepton kiềm mặn chúng tôi có một số nhận xét ( Bảng 3.14) với 8 bệnh nhân khi vào viện được lấy bệnh phẩm ngay trước khi điều trị bằng kháng sinh thì nhận thấy trên môi trường peptone cấy lần thứ nhất xuất hiện váng nghi tả hơi xám, mỏng, lắc khó tan, sau 4 giờ xen lẫn với váng của tạp khuẩn, sau 8 giờ bằng các phương pháp khác nhau chúng tôi đã trả lời dương tính với V. cholerae.
Đồng thời có 6 bệnh nhân phân lập được vi khuẩn tả phải sau 2 lần cấy tăng sinh và 2 bệnh nhân phải sau 3 lần cấy tăng sinh như vậy mới phân lập được điều đó hoàn toàn giống các nghiên cứu khác vì bệnh nhân đã điều trị bằng kháng sinh nên tỷ lệ vi khuẩn ít do vậy khó phân lập hơn. Nếu lấy bệnh phẩm sau 2 ngày sử dụng kháng sinh thì khả năng phát hiện mầm bệnh là rất khó.
Một số nhận xét của Thẩm Chí Mục, Phạm Trọng Năm nhận xét về khuẩn lạc trên môi trường đặc và váng của V. cholerae mọc trên môi trường lỏng sẽ dẫn tới sự nhanh chóng chính xác trong khâu trả kết quả. Trong đó có
đưa ra trên những bệnh nhân có bệnh cảnh lâm sàng điển hình không phải cấy chuyển giai đoạn 2. Những bệnh nhân đã dùng kháng sinh và người lành trong ổ dịch mang vi khuẩn thì phải tăng sinh đến giai đoạn 3 hoặc 4 mới phát hiện được. Trong quá trình nuôi cấy nếu kết hợp quan sát váng của vi khuẩn và khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch kiềm thì tỷ lệ phát hiện dương tính rất cao. Ở tuyến huyện chỉ cần môi trường pepton kiềm qua cấy truyền nhiều lần theo dõi váng của vi khuẩn tả, lấy váng nghi ngờ làm phản ứng ngưng kết sơ bộ nếu ngưng kết gửi lên tuyến trên xác định đồng thời có biện pháp chống dịch ngay [29].
* Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza
Thử nghiệm khả năng lên men đường bằng cách dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ V. cholerae cấy vào ống môi trường basicop, sau đó ủ nhiệt độ 37oC/ 18-24 giờ . Đối với V. cholerae thử nghiệm khả năng lên men của 3 loại đường (saccaroza 30%, mannoza 10%, arabinoza 30%), vi khuẩn lên men đường sẽ làm axít hoá môi trường và môi trường chuyển từ xanh lá cây sang vàng. Do vậy khi tiến hành đọc kết quả môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính và giữ nguyên màu môi trường xanh lá cây là âm tính.