3. NỘI DUNG THỰC TẬP
3.4. Staphylococcus aureus trong nguyên liệu và sản phẩm (TCVN 4830:2005)
3.4.1. Staphylococcus aureus
- Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose.
- Tất cả dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chưa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu. Hầu hết đều tạo sắc tố vàng sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.
𝐴 (𝐶𝐹𝑈
𝑔 ℎ𝑎𝑦𝐶𝐹𝑈
𝑚𝑙 ) = 𝑁
𝑛1. 𝑉. 𝑓1 + ⋯ + 𝑛𝑖. 𝑉. 𝑓𝑖
Hình 3.3. Vi khuẩn Staphylococcus
- S. aureus phân bố khắp nơi nhưng chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày của người và động vật máu nóng. S. aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm.
- Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.
3.4.2. Nguyên tắc
S. aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.
Nguyên tắc xác định sự có mặt và định lượng số lượng của Staphylococcus Aureus trong thực phẩm dựa vào sự xuất hiện của khuẩn lạc điển hình ( chỉ định bởi sự khử của kali tellurite leicithin lòng đỏ trứng ) trên môi trường phân lập Baird – Parker và phản ứng dương tính coagulase trong dịch huyết tương
3.4.3. Vật liệu
- Barid Parker Agar (BPA), lòng đỏ trứng tươi.
- Brain heart infusion (BHI) broth.
- Huyết tương thỏ: huyết tương thỏ được cố định bằng 0.1% EDTA hay sodium oxalate và được phân phối 0.3ml vào ống nghiệm.
- Dịch pha loãng: Buffered pepton water.
3.4.4. Quy trình
Sơ đồ 3.6. Quy trình phân tích Staphylococcus aureus Bước 1: chuẩn bị mẫu
- Cân 10 g mẫu vào túi PE, rót vào 90ml Buffered pepton water
- Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong thời gian tối đa 2.5 phút (thường là 1 phút) ta được dịch mẫu có độ pha loãng 10-1.
- Pha loãng tiếp các nồng độ 10-2,10-3,…
Bước 2: Đổ đĩa và ủ mẫu
- Rót môi trường BPA vào các đĩa petri vô trùng.
- Mẫu dạng lỏng: hút trực tiếp 0,1 ml mẫu cho mỗi đĩa petri đã chứa môi trường BPA, thực hiện với 2 đĩa petri.
Mẫu
Phân lập (Dàn đều 0,1ml dd mẫu lên 2 đĩa môi trường BPA, ủ 370C, 24 - 48h)
Đồng nhất mẫu Pha loãng
Đếm số khuẩn lạc điển hình
Đông huyết tương. Mức độ đụng ắ trở lờn được xem là
dương tính
Khẳng định (chọn 5 khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường)
Coagulase test( cho 0,1ml BHI vào 0,3 ml huyết tương thỏ ủ 370C/4-6h)
Không hình thành khối đông huyết tương( hỗn hợp đồng nhất
- Mẫu không phải dạng lỏng: chuyển 0,1 ml mẫu đã pha loãng ở 2 nồng độ liên tiếp lên đĩa petri chưa môi trường BPA, mỗi nồng độ 2 đĩa petri..
- Dùng que trải thủy tinh trang đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô, sau đó lật ngược đĩa.
- Ủ tất cả các đĩa ở 370C trong (24 - 48) h, chọn khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng cấy vào môi trường tăng sinh ủ ở 350C trong 24h.
- Hút 0.1ml canh BHI cho vào 0.3ml huyết tương thỏ, ủ ở 350C và kiểm tra phản ứng đông huyết trong mỗi 6h trong 24h. (Với môi trường thạch máu thực hiện tương tự).
Bước 3: Đếm kết quả
- Đếm khuẩn lạc trên các đĩa petri. Khuẩn lạc đặc trưng: có màu đen hoặc xám, bóng, lồi, có vòng phân giải không màu bao quanh.
Bước 4: Cấy khẳng định
- Chọn 5 khuẩn lạc cho mỗi nhóm (điển hình hay không điển hình) cấy vào thang BHI ủ ở 350C trong 24h.
- Hút 0,1 ml canh BHI cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ, ủ ở 35oC và kiểm tra phản ứng đông huyết mỗi 6h trong vòng 24h.
- Dương tính khi có khối huyết tương hình thành đông kết ở mọi mức độ. Âm tính dung dịch đồng nhất.
3.4.5. Biểu diễn kết quả
Trong đó:
F: độ pha loãng của dịch huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng đầu tiên đã cấy.
Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng.
Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng.
Ht: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc.đặc trưng.
Ha: tỉ số giữa khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc không đặc trưng.
Mật độ (CFU
g hayCFU
ml ) = 10(NtHt + NaHa) F