CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3 Xây dựng phương pháp định lượng một số thành phần chính của hỗn
Số liệu phân tích định tính các dịch chiết từ cây Khổ sâm cho biết các ent -kauran trong lá và cành của Croton tonkinensis thường có chứa 3-4 thành phần chính, tuỳ thuộc vào bộ phận dùng (lá, cành), thời điểm thu hái và nơi sinh trưởng.
Để có thể xác định một cách đồng thời hàm lượng các ent -kauran chính ở trong nguyên liệu, chúng tôi dùng phương pháp LC -MS là do phương pháp này đáp ứng được các yêu cầu nhanh, nhậy, có tính chọn lọc cao và trong cùng một mẫu phân tích.
Để thực hiện phương pháp này, chúng tôi đã lựa chọn các thông số kỹ thuật đáp ứng chế độ tối ưu cho hệ thống LC -MS gồm: cột phân tích Zorbax SB-C18, RP (3.0 150mm), detector DAD ( = 254nm) và MS (ESI- Electron spray ionisation), hệ dung môi MeOH -H2O (gradien 10 :90), tốc độ dòng 0,4ml/phút, thời gian ghi 30 phút.
Việc xây dựng đường chuẩn cho mẫu phân tích được thực hiện với 7 nồng độ khác nhau. Từ các số liệu về sự tương quan giữa nồng độ với diện tích tích phân trên sắc ký đồ sẽ xác định các tham số của phương trình hồi qui ở dạng y = ax + b.
Nguyên tắc chung của phương pháp này là từ đám mây điểm thực nghiệm chọn đường hồi qui lý thuyết sao cho tổng bình phương các hiệu sai từ các trị số quan sát được từ mẫu yi so với trị số lý thuyết của phương trình hồi qui là nhỏ nhất [11].
Mẫu chuẩn được cân chính xác 50mg cho vào bình định mức 50ml, sau đó thêm MeOH cho đến vạch chuẩn sẽ được dung dịch gốc. Pha loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,001 ; 0,005 ; 0,01 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,
44 2 và 0,5mg/ml.
Các chất Crotonkin -1, Crotonkin-2, Crotonkin-3 tinh khiết mô tả ở mục 3.2 là những ent -kauran chủ yếu của cây Khổ sâm cho lá, chúng được dùng làm mẫu chuẩn để xây dựng đường chuẩn trong phân tích định lượng theo phương pháp LC -MS.
3.3.1 Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan của Crotonkin -1
Dùng 50mg Crotonkin -1 để chuẩn bị dung dịch gốc và tạo ra 7 dung dịch với nồng độ khác nhau, bơm 1 l vào cột và chạy 30phút/ 1lần đo. Các nồng độ chất chuẩn crotonkin -1 được đo lặp lại 3 lần trên thiết bị LC -MS để lấy giá trị trung bình. Các số liệu tương quan giữa nồng độ với diện tích tích phân ở các nồng độ khác nhau ghi trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 : Tương quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ khác nhau của crotonkin -1
Stt Nồng độ Diện tích thực nghiệm
Diện tích lý thuyết
Thời gian (phút)
Khối lƣợng phân tử
[M]+
1 0.001 46.01477 133.97966 23.9 360
2 0.005 93.43894 162.4191 23.9 360
3 0.01 108.5686 197.9684 23.9 360
4 0.05 448.9195 482.3628 23.9 360
5 0.1 886.9082 837.8558 23.9 360
6 0.2 1939.755 1548.8418 23.9 360
7 0.5 3521.622 3681.7998 23.9 360
Các số liệu ở bảng 3.3 chỉ ra tính ổn định cao về giá trị tích phân (S),
45
khối lượng phân tử (M) và thời gian lưu (Rt = 23, 9 phút) của Crotonkin -1.
Dùng phương pháp bình phương tối thiểu và từ các số liệu ở bảng 3.3 đã xác định được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -1 có:
a = 7109,8596 ; b = 126, 8697 và hệ số tương quan R = 0,989908.
Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -1 là:
y = 7109,8596. XCT-1 + 126,8697.
y: Diện tích pic thu được trên phổ LC -MS XCT-1: Hàm lượng (mg/ml) của Crotonkin -1
Đ-ờng chuẩn của D1
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Nồng độ (mg/ml)
Diện tích
Dien Tich LT
Hình 3.1 : Đường chuẩn Crotonkin -1
3.3.2 Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan của Crotonkin -2
Dùng 50mg Crotonkin -2 và làm tương tự như trên, các số liệu thu được ghi trong bảng 3.4.
46
Bảng 3.4 : Tương quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ khác nhau của Crotonkin -2
STT Nồng độ Diện tích
thực nghiệm Diện tích lý thuyết
Thời gian (phút)
Khối lƣợng phân tử [M]+
1 0.001 40.21345 22.143177 21.1 376
2 0.005 42.04944 48.772285 21.6 376
3 0.01 69.21092 82.05867 21.6 376
4 0.05 363.3754 348.34975 21.6 376
5 0.1 677.5821 681.2136 21.6 376
6 0.2 1331.266 1346.9413 21.6 376
7 0.5 3349.907 3344.1244 21.6 376
Dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu và các số liệu ở bảng 3.4 đã thu được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -2 có
a = 6657,277 ; b = 15, 48592 và hệ số tương quan R = 0,9999391 Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -2 là:
Y = 6657,277 . XCT-2 + 15,48592
Đ-ờng chuẩn của CT1
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Nồng độ (mg/ml)
Dien tich
Dien tich LT
Hình 3.2: Đường chuẩn Crotonkin - 2
47
Tính ổn định cao trong các lần đo lặp lại cũng như sự tương quan chặt chẽ giữa các nồng độ chất chuẩn và diện tích thu được cả trên phổ LC -MS được phản ánh bởi hệ số tương quan R trong phương trình tương quan của Crotonkin -1 (0,989968) và của Crotonkin -2 (0,999939) là rất cao.
Như vậy phép định lượng mỗi chất trong hỗn hợp bằng phương pháp LC -MS là ưu việt, đáp ứng các yêu cầu nhanh, nhậy và chọn lọc khi đánh giá chất lượng nguyên liệu bán thành phẩm cũng như thành phẩm trong quá trình nghiên cứu và sản xuất.
3.3.3. Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan của Crotonkin -3
Dùng 50mg Crotonkin -3 và làm tương tự như trên, các số liệu thu được ghi trong bảng 3.5.
Bảng 3.5 : Tương quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ khác nhau của Crotonkin -3
Stt Nồng độ Diện tích pic
Thời gian (phút)
Píc phân tử [M+H-H2O]+
1 0.1 27.603 24,01 345
2 0.2 84.366 24,01 345
3 0.4 197.892 24,01 345
4 0.5 254.655 24,01 345
5 0.8 424.944 24,01 345
48
Đ-ờng chuẩn của D2
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Nồng độ
Diện tích píc
D
Hình 3.3: Đường chuẩn Crotonkin - 3
Dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu và các số liệu ở bảng 3.5 đã thu được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -3 có
a = 567,63 ; b = 29, 16 và hệ số tương quan R = 0,9740 Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -3 là:
Y = 567,63 . XD-2 + 29,16
y: Diện tích pic thu được trên phổ LC -MS XD-2: Hàm lượng (mg/ml) của Crotonkin -3
Cũng như Crotonkin -1 và Crotonkin -2 tính ổn định cao trong các lần đo Crotonkin -3 lặp lại cũng như sự tương quan chặt chẽ giữa các nồng độ chất chuẩn và diện tích thu được ở trên phổ LC -MS được phản ánh bởi hệ số tương quan R trong phương trình tương quan của Crotonkin -3 (0,9740) là rất cao.
3.3.4. Xác định hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong cây Khổ sâm
Cân lấy một khối lượng nguyên liệu (M) ngâm chiết và thu cặn chiết giàu ent -kauran (m). Cân chính xác 1mg cặn chiết và ghi trên máy LC -MS.
Từ phương trình tương quan (y = ax + b) và diện tích tích phân LC -MS
49
của mỗi chất sẽ tính được khối lượng của chất đó trong 1mg cặn chiết (m) và hàm lượng (%)của Crotonkin trong nguyên liệu tính theo công thứcc:
% crotonkin = m
a M
yCT - b 100
x x (3.1)
Trong đó yCT: diện tích tích phân trên phổ đồ LC -MS ứng với Rt của Crotonkin
a, b: Các hệ số trong phương trình tương quan của crotonkin Crotonkin-1 có a = 7109,85, b = 126,87
Crotonkin-2 có a = 6657,28, b = 15,48
m: cặn chiết giàu ent -kauran thu đựơc từ khối lượng M M: khối lượng nguyên liệu đem phân tích.
Ví dụ cách tính: 200g (M) lá khô nghiền nhỏ thu hồi tháng 5/2007 ở Sóc Sơn - Hà Nội được ngâm chiết kiệt, làm giầu ent -kauran thu được 23, 4g cặn thô. Cân chính xác 1mg cặn chiết và đưa phân tích trên máy LC-MS thu được sắc ký đồ ký hiệu M107.
Trên sắc ký đồ M107 cho biết diện tích tích phân LC -MS tương ứng với Rt của Crotonkin như sau: yCT Rt
Crotonkin-1 388,463 23,96 Crotonkin-2 196,815 21,60
Thay bằng số vào công thức (3.1) ta có:
% crotonkin-1 = 23,4
7109,86 200
388,463-126,87 100
x x = 0,43
% crotonkin-2 = 23,4
6657,28 200
196,815-15,48 100
x x = 0,32
50
3.3.4.1. Xác định hàm lượng của crotonkin trong lá và cành Khổ sâm theo các thời điểm khác nhau 3
Theo dõi sự biến động hàm lượng các Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong cành và lá cây Khổ sâm trồng ở Sóc Sơn - Hà Nội cho kết quả ghi trong bảng 3.6
Bảng 3.6: Hàm lƣợng Crotonkin chủ yếu của lá và cành Khổ sâm thu ở Sóc Sơn - Hà Nội theo một số thời điểm trong năm
STT Thời gian lấy
mẫu Bộ phận Hàm lƣợng (%)
Crotonkin-1 Crotonkin-2
1 4/2007 Lá 0,335 0,192
2 Cành 0,062 0,048
3 5/2007 Lá 0,430 0,320
4 Cành 0,360 0,350
5 11/2007 Lá 0,520 0,560
6 Cành 0,530 0,530
3.3.4.2. Xác định hàm lượng của Crotonkin chủ yếu của lá Khổ sâm ở các vùng sinh trưởng khác nhau 3
Bảng 3.7: Hàm lƣợng một số ent -kauran chủ yếu của lá Khổ sâm thu ở một số vùng khác nhau
Bộ phận
cây Địa điểm Thời gian
thu mẫu Hàm lƣợng (%) Crotonkin-1
Hàm lƣợng (%) Crotonkin-2
Lá Sóc Sơn 5/2007 0,43 0,32
Lá Ninh Bình 5/2006 0,74 0,50
Lá Phú Thọ
9/2007 0,73 0,78
Lá Ninh Bình 0,80 0,70
Lá Sóc Sơn
11/2007 0,52 0,56
Lá Hưng Yên 0,75 0,50
Từ cặn chiết giàu ent -kauran của các mẫu Khổ sâm theo các phổ LC -
51
MS (xem phụ lục). Sau khi xử lý số liệu đã thu kết quả phân tích hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 theo các thời điểm trong năm (bảng 3.6) và theo vùng nguyên liệu (bảng 3.7). Đánh giá các số liệu trong 2 bảng này đã quan sát thấy hàm lượng các Crotonkin chủ yếu của cây Khổ sâm có sự biến động rõ rệt:
Hàm lượng của các Crotonkin trong cây tăng dần từ mùa xuân hè và đạt mức cao nhất vào mùa thu hàng năm. Hàm lượng Crotonkin -1 trong mùa xuân hè luôn cao hơn Crotonkin -2 từ 1, 74 đến 1, 34 lần ở l á, và từ 1, 29 đến 1, 03 lần ở cành, nhưng sang mùa thu thì chênh lệch không đáng kể.
Những số liệu phân tích ban đầu cho thấy: lá cây khổ sâm thu ở các vùng trung du (Bắc Giang, Phú Thọ, Ninh Bình) có hàm lượng ent -kauran luôn cao hơn những cây trồng ở Sóc Sơn - Hà Nội.
Từ những kết quả nghiên cứu sơ bộ về sự biến động hàm lượng hoạt chất của cây Khổ sâm đã có cơ sở để nói rằng: nguyên liệu tốt nhất để chiết xuất Crotonkin -1 và Crotonkin -2 là dùng lá cây Khổ sâm ở vùng trung du thu hái vào mùa thu hằng năm.
Đã xây dựng được phép định lượng đồng thời hàm lượng Crotonkin-1 và Crotonkin-2 trong hỗn hợp. Xác định đ-ợc thời điểm thu nguyên liệu để chiết xuất hoạt chất chính.