Đối với Sâm gọc inh bộ phận thí nghiệm là đầu (mầm, thân, rễ).
Chọn chồi mọc th ng hay chồi bên làm nguyên liệu nuôi cấy có chiều dài -3 cm, cắt bỏ hết lá, xử lý bằng cồn 70 % trong 1 phút ở tủ cấy vô trùng, sau đó tráng lại lần bằng nước cất vô trùng, sau đó xử lý mẫu bằng dung dịch hypoclorid canxi hay HgCl2 sau đó tráng bằng nước cất vô trùng nhiều lần cho sạch hết chất khử trùng.
Sau khi khử trùng xong cắt phần đầu có màu xanh, chiều dài 0. cm đặt vào môi trường.
Bảng 3.1: nh h ởng của các oại nồng độ kh trùng:
Mẫu ố mẫu HgCl2
Sâm gọc
Linh (Mầm,
thân, rễ)
10 0.2% 0.3% 0.4%
Thời gian (phút)
5 10 15 20 5 5 15 20 5
100% 100% 100% 20% 40% 40% Chết Chết Chết
Mẫu ố mẫu Ca(OCl)2
Sâm gọc
Linh (mầm,
thân, rễ)
10 5% 10% 15%
Thời gian (phút)
10 15 20 5 10 15 5 10
100% 100% 100% 40% Chết Chết Chết Chết
Kết uả:
Sâm gọc inh xử lý bằng gCl2 với nồng độ 0. % trong thời gian 20 phút thì tỷ lệ nhiễm thấp ( 0%) và tỷ lệ nhiễm không cao (80%). Còn đối với xử lý bằng Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian 5 phút thì tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) và tỷ lệ không nhiễm cao (90%). (Bảng .1).
3.6.2. Khảo át ảnh h ởng của các tổ h hoocmon ên ự hát inh hình thái:
Sử dụng các mẫu mầm, thân, rễ Sâm gọc inh. uôi cấy phối hợp trên các tổ hợp môi trường khác nhau để đánh giá sự phát sinh hình thái.
Bảng 3.2: nh h ởng của các tổ h hoocmon ên ự hát inh hình thái của âm Ngọc Linh cấy mô:
Đối t ng
Bộ hận
cấy Hoccmon Kết uả hát
inh hình thái
Sâm gọc
Linh
Mầm, thân, rễ
IBA IAA NAA K 2ip G
0.2 0.2 Chết
0.5 0.5 Chết
0.5 1 Callus
0.2 0.5 Callus
0.5 0.25 ễ
0.5 1 1 Phôi soma
0.5 3 0.5 Phôi chồi
8 0.5 ễ
1 3 Chồi
Kết uả:
- Với tổ hợp hoocmon IB 0.5 + ip 1 thì Sâm gọc inh phát sinh phôi soma.
- Với tổ hợp hoocmon 1 + G thì phát sinh phôi chồi.
- Với tổ hợp hoocmon 8 + ip 0.5 thì phát sinh rễ.
3.6.3. nh h ởng của điều kiện chiếu áng ên khả năng tạo mô o từ á và cuống á:
Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo. Đối với mẫu lá, đa số trường hợp thì sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn ngoài sáng. Tuy nhiên, một số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt hơn trong điều kiện sáng.
Môi trường tốt nhất cho sự tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu lá và cuống lá được dùng để khảo sát điều kiện chiếu sáng. Mẫu được đặt trong hai điều kiện tối hoàn toàn và chiếu sáng (1 giờ/ ngày).
Bảng 3.3: nh h ởng của điều kiện chiếu áng ên khả năng tạo mô o từ á và cuống á:
2,4-D (mg/l) Bộ hận Phần trăm tạo mô o (%)
Chiếu áng (16 gi / ngày) Tối hoàn toàn 0.5
Lá
20 30
1.0 90 80
2.0 90 90
3.0 80 80
0.5
Cuống lá
100 100
1.0 100 100
2.0 100 100
3.0 100 100
Kết uả:
ết quả ở bảng 3. cho thấy tỷ lệ phát sinh mô sẹo trên các mẫu lá và cuống lá gần như tương đương giữa hai điều kiện chiếu sáng và tối, nhưng lượng mô sẹo trong điều kiện tối ít hơn và chất lượng mô sẹo cũng kém hơn do có hiện tượng thủy tinh thể, nhất là môi trường có .0 mg/l , -D.
3.6.4. nh h ởng của kích th ớc mẫu cấy ban đầu ên ự tăng inh mô o:
Mô sẹo được cắt theo ba kích thước: T1, T , T . Mẫu mô sẹo với kích thước xác định được cấy vào môi trường nhân nhanh.
Mô sẹo sau quá trình tăng sinh được sử dụng cho quá trình tái sinh chồi và rễ bất định.
Bảng 3.4: nh h ởng của kích th ớc mẫu cấy ban đầu ên ự tăng inh mô o:
Chỉ tiêu uan át KT1
(0.5*0.5)
KT2 (0.7*0.7)
KT3 (1.0*1.0) Trọng lượng tươi ban đầu (mg) 147 6 267 ± 18 576 ± 24
Sinh khối sau tuần nuôi
cấy
ích thước
(cm) 1.1*0.9 1.4*1.0 1.6*1.2
Trọng lượng tươi
(mg) 667 ± 45 804 ± 35 1505 ± 66
Trọng lượng khô
(mg) 53.9 ± 36 57.8 ± 2.5 102.8 ± 4.5 Tỷ lệ chất khô
( %) 8.08 7.19 6.83
Tỷ lệ tăng sinh khối khô 5.46 3.22 2.65
Kết uả:
ích thước mẫu cấy là một yếu tố quan trọng trong nhân giống invitro. Khi khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo, ta nhận thấy kích thước nhỏ nhất ( T1) cho hiệu quả tốt nhất về tỷ lệ tăng sinh khối lẫn trọng lượng khô, trong khi đó không có sự khác biệt nhiều về khả năng tăng sinh giữa T và KT3 (Bảng 3. ). Sự tương quan này có thể bắt nguồn từ tương quan giữa kích thước mẫu cấy - khả năng thu nhận dinh dưỡng từ môi trường và do ảnh hưởng của các chất thải nội sinh của mô sẹo trong quá trình nuôi cấy.
3.6.5. nh h ởng của auxin ên khả năng khởi tạo mô o từ á và cuống á:
hững nghiên cứu đã có trên các đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có sự kết hợp giữa cytokinin và auxin.
Mẫu lá và cuống lá sau khi được khử trùng được cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ và các loại auxin , -D, IBA, , với nồng độ thay đổi từ 0.5;
1.0; .0 và .0 mg/l. Mẫu lá được đặt ngửa trên mặt môi trường và cuống lá cũng được đặt ngửa (Vết cắt hướng lên trên).
Bảng 3.5: nh h ởng của auxin ên khả năng khởi tạo mô o từ á và cuống á:
Auxin Nồng độ auxin ( mg/ ) Tỷ ệ tạo mô o (%) Cuống á Lá
2,4-D
0.5 100 20
1.0 100 90
2.0 100 90
3.0 100 80
IBA
0.5 0 0
1.0 0 0
2.0 0 0
3.0 0 0
NAA
0.5 0 0
1.0 0 0
2.0 0 0
3.0 0 0
Kết uả:
ết quả thu được sau 8 tuần nuôi cấy được ghi nhận trong bảng 3.5. Trong ba loại auxin được bổ sung vào môi trường thì chỉ có , -D có khả năng kích thích lá và cuống lá tạo mô sẹo. Trên môi trường bổ sung 1.0 mg/l , -D, các mẫu cấy có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất (Đạt 90 % đối với lá và 100 % đối với cuống lá), có lượng sẹo hình thành nhiều nhất, cấu trúc chắc và có màu vàng sáng. nồng độ .0
mg/l 2,4-D, mô sẹo bắt đầu có hiện tượng thủy tinh thể. Do đó, ở nồng độ , -D từ .0 mg/l trở lên không phù hợp cho sự phát sinh mô sẹo.
3.6.6. nh h ởng của auxin ên khả năng tăng inh mô o âm Ngọc Linh:
Các mẩu mô sẹo được tạo từ giai đoạn khởi tạo được cấy vào môi trường MS bổ sung 0. mg/l TDZ và các loại auxin , -D, IB và với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0; .0 và 5.0 mg/l trong điều kiện chiếu sang 1 giờ/ ngày.
Bảng 3.6: nh h ng của auxin ên khả năng tăng inh mô o âm Ngọc Linh:
Auxin Nồng độ (mg/l)
Trọng ng t i
ban đầu (mg)
inh khối au 4 tuần nuôi cấy Tỷ ệ tăng sinh khối khô Trọng ng
t i (mg)
Trọng ng khô
(mg/l)
Tỷ ệ chất khô
(%)
2,4-D
0.5 203 ± 16 584 ± 34 43.3 ± 2.5 7.42 3.18 1.0 212 ± 14 809± 37 66.2 ± 3.0 8.18 4.56 2.0 204 ± 17 711 ± 32 52.4 ± 2.4 7.37 3.73 3.0 205 ± 9 508 ± 24 36.6 ± 2.2 7.21 2.65 5.0 201 ± 13 493 ± 38 34.6 ± 1.7 7.01 2.50
IBA
0.5 197 ± 18 474 ± 23 45.6 ± 2.2 9.62 3.45 1.0 203 ± 19 532 ± 29 48.6 ± 2.7 9.14 3.56 2.0 207 ± 13 631 ± 32 49.5 ± 2.5 7.84 3.63 3.0 203 ± 15 552± 26 41.1 ± 1.9 7.45 3.10 5.0 209 ± 12 531 ± 23 35.3 ± 1.5 6.66 2.53
NAA
0.5 218 ± 8 485 ± 13 41.2 ± 1.1 8.49 2.81 1.0 212 ± 14 548 ± 21 45.0 ± 1.8 8.22 3.33 2.0 206 ± 15 588 ± 18 46.6 ± 1.4 7.92 3.37 3.0 199 ± 7 602 ± 32 45.7 ± 2.4 7.60 3.38 5.0 205 ± 14 720 ± 48 51.6 ± 3.4 7.20 3.77
Kết uả:
Bảng 3. cho thấy sau quá trình tăng sinh, mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có 0.5 mg/l IB có tỷ lệ chất khô cao nhất 9. % nhưng tỷ lệ tăng sinh khối khô cao nhất là .5 lần lại thu được ở mô sẹo trên môi trường có , -D ở nồng độ 1.0 mg/l.
Có thể sự kết hợp giữa auxin và cytokinin đã làm tăng khả năng thu nhận đường và các chất dinh dưỡng khác từ môi trường của mô sẹo và kéo theo sự tăng sinh của mô sẹo, đặc biệt là tăng tỷ lệ chất khô. IB có thể là auxin kích thích sự thu nhận dinh dưỡng từ môi trường khi kết hợp với TDZ tốt hơn so với và , -D.
ết quả là tỷ lệ chất khô của mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có IB cao nhất trong ba loại auxin sử dụng. Tuy IB cho tỷ lệ mô sẹo có tỷ lệ chất khô cao nhất nhưng , -D có tỷ lệ tăng sinh khối khô cao nhất (Gấp .5 lần) và có tỷ lệ chất khô tương đối cao (8.18 %). Mặt khác, mô sẹo trên môi trường , -D có hình thái tốt nhất, là dạng mô sẹo có khả năng tái sinh cao.
3.6.7. nh h ởng của BA và NAA đến khả năng tái inh chồi từ mô o:
Các mô sẹo thu được trong thí nghiệm nhân nhanh mô sẹo được tách và chuyển vào mụi trường ẵ MS cú bổ sung B và với cỏc nồng độ trong bảng 3.6.
Kết uả:
Tỷ lệ giữa auxin và cytokinin đóng vai trò cần thiết cho tái sinh chồi, cytokinin thường thúc đẩy sự hình thành chồi và quá trình này thường được kích thích khi bổ sung auxin với nồng độ thấp. Trong thử nghiệm, khi sử dụng B kết hợp với kết quả nhận thấy các tổ hợp và B khác nhau, sự kết hợp giữa 1.0 mg/l B và 1.0 mg/l cho số chồi đạt cao nhất là . chồi/ mẫu và trọng lượng trung bình là 0.185 g (Bảng .7).
Bảng 3.7: Khả năng tái inh chồi từ mô o trên môi tr ng M có bổ ung BA và NAA:
BA (mg/l) NAA (mg/l) ố ng chồi/ mẫu Trọng ng chồi (g)
0.5
0.5 5.0 0.106
1.0 6.1 0.141
1.5 4.6 0.193
2.0 3.3 0.197
2.5 3.0 0.094
1.0
0.5 5.5 0.163
1.0 6.3 0.185
1.5 5.9 0.158
2.0 3.9 0.148
2.5 3.7 0.157
2.0
0.5 4.2 0.152
1.0 5.5 0.141
1.5 2.9 0.144
2.0 2.8 0.112
2.5 2.7 0.108
4.0
0.5 3.3 0.154
1.0 3.0 0.122
1.5 2.6 0.122
2.0 0.8 0.108
2.5 0 0
3.6.8. nh h ởng của BA ên uá trình tăng tr ởng chồi âm Ngọc Linh invitro:
hững chồi tốt nhất sau khi thu nhận được thì được tách và chuyển vào môi trường ẵ MS cú bổ sung 1.0 g/l than hoạt tớnh, 0 g/l sucrose, 0.5 mg/l và BA ( 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg/l).
Bảng 3.8: nh h ởng của BA ên uá trình tăng tr ởng chồi âm Ngọc Linh invitro:
BA (mg/l) Trọng ng t i (g) Chiều cao chồi (cm) ố ng á/ chồi
0.5 0.61 5.66 3.0
1.0 0.87 6.16 3.3
2.0 0.72 4.11 4.0
4.0 0.71 4.33 3.9
Kết uả:
Trong các nồng độ B đươc sử dụng, nồng độ 1.0 mg/l B kết hợp với 0.5 mg/l cho kết quả tăng trưởng chồi chốt nhất với trọng lượng tươi của chồi là 0.87 g và chiều cao chồi là .1 cm (Bảng 3.8). Vậy môi trường nuôi cấy có bổ sung 1.0 mg/l B và 0.5 mg/l tốt nhất cho quá trình tăng trưởng chồi.
3.6.9. nh h ởng của nồng độ đ ng đến khả năng tăng tr ởng chồi:
hững chồi tốt nhất trong thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường ẵ MS cú bổ sung 0.5 mg/l , 1.0 mg/l B , p 5.7 và đường với cỏc nồng độ đường là 10; 0; 0; 0; 50; 0 g/l.
Kết uả:
Qua các kết quả thử nghiệm cho thấy sucrose là carbohydrate hào tan chiếm ưu thế và nồng độ thường dùng nằm trong khoảng 0 - 1 0 g/l sucrose. ghiên cứu ảnh hưởng của sucrose lên sự tăng trưởng chồi Sâm gọc inh sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy việc bổ sung sucrose vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực lên sự sinh trưởng chồi. Sự gia tăng nồng độ sucrose trong môi trường không những kích thích sinh trưởng chồi Sâm gọc inh mà còn có tác dụng mạnh đến sự biến đổi
khối lượng của chúng. ồng độ 50 g/l sucrose cho kết quả tốt nhất về trọng lượng, chiều cao và số lượng lá (Bảng .9).
Bảng 3.9: nh h ởng của nồng độ đ ng đến khả năng tăng tr ởng chồi:
Sucrose (g/l) Trọng ng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) ố ng á/ chồi
10 0.49 4.4 2.2
20 0.55 5.4 2.5
30 0.68 5.7 2.6
40 1.06 5.8 3.2
50 1.46 6.1 3.5
60 1.28 6.1 3.2
3.6.10. nh h ởng của than hoạt tính đến khả năng tăng tr ởng chồi invitro:
hững chồi tốt nhất trong thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường ẵ MS cú bổ sung 0.5 mg/l , 1.0 mg/l B , p 5.7 với cỏc nồng độ than hoạt tính lần lượt là 1.0; 2.0; 3.0 và 4.0 g /l.
Bảng 3.10: nh h ởng của than hoạt tính đến khả năng tăng tr ởng chồi invitro:
Than hoạt
tính (g/l) Trọng ng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) ố ng á/ chồi
0 0.53 3.3 3.6
1.0 0.61 4.6 3.7
2.0 1.01 5.3 3.3
3.0 0.97 6.8 2.7
4.0 0.94 8.5 3.1
Kết uả:
Than hoạt tính không phải là một chất điều hòa sinh trưởng thưc vật, nhưng nó có khả năng thay đổi thành phần môi trường. Than hoạt tính điều chỉnh p môi
trường, hấp thụ các chất làm cản trở sự phát triển của mô. ết quả thu được cho thấy khi nồng độ than hoạt tính tăng thì có sự thay đổi r rệt về trọng lượng cũng như chiều cao của chồi, nhưng số lượng lá không có sự thay đổi đáng kể. Trọng lượng chồi đạt cao nhất trên môi trường chứa .0 g/l than hoạt tính là khoảng 1.01 g/chồi, tăng 1.9 lần so vời đối chứng (Bảng 3.10). Vậy nồng độ .0 g/l than hoạt tính là phù hợp nhất cho qúa trình tăng sinh chồi Sâm gọc inh.
3.6.11. nh h ởng của IAA IBA NAA đến khả năng ra r bất đ nh từ mô o:
Mô sẹo được cấy vào môi trường ra rễ có chứa các auxin ( , IB , I ) ở các nồng độ lần lượt là 1.0; .0; 5.0; 7.0 mg/l.
Bảng 3.11: nh h ởng của IAA IBA NAA đến khả năng ra r bất đ nh từ mô o:
Auxin Nồng độ ( mg/l)
Tỷ ệ ra r (%)
ố ng r / mẫu
Tỷ ệ khối ng r / mẫu (%)
Chiều dài tối đa của r (mm)
NAA
1.0 30 3.0 ± 0.3 5.98 18
3.0 100 8.7 ± 0.1 21.88 13
5.0 70 2.6 ± 0.1 6.23 9
7.0 50 2.1 ± 0.1 12.21 8
IAA
1.0 0
3.0 0
5.0 10 0.2 ± 0.2
7.0 0
IBA
1.0 70 1.6 ± 0.1 7.83 16
3.0 80 4.0 ± 0.3 5.21 21
5.0 100 4.8 ± 0.3 15.81 18
7.0 60 3.5 ± 0.1 8.06 1.7
Kết uả:
Quá trình khảo sát ảnh hưởng của ba loại auxin trên, ta nhận thấy IAA không thích hợp cho quá trình ra rễ Sâm gọc inh từ mô sẹo vì auxin này hầu như không kích thích mô sẹo ra rễ bất định. và IB thì ngược lại. ồng độ .0 mg/l cho kết quả tố nhất với tỷ lệ ra rễ lên đến 100 %, số lượng rễ/ mẫu lớn nhất (8.7 rễ/
mẫu), tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu lớn nhất ( 1.88 %), chiều dài tối đa của rễ là 13 mm (Bảng 3.11). IB ở nồng độ 5.0 mg/l cho tỷ lệ ra rễ đạt 100 %, Số lượng rễ trung bình/ mẫu .8 mẫu, tỷ lệ khối lượng 15.81 % và chiều dài tối đa của rễ là 18 mm.
ết quả này có thể được giải thích do auxin tổng hợp có hoạt tính cao hơn dạng tự nhiờn. Vậy hai mụi trường kớch thớch ra rễ tốt là mụi trường Ms ẵ bổ sung .0 mg/l và mụi trường MS ẵ bổ sung 5 mg/l IB .
3.6.12. nh h ởng của IBA và NAA đến khả năng nhân r bất đ nh:
ễ bất định sau khi được tạo ra ở các thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường nhân rễ có bổ sung các auxin , IB ở các nồng độ lần lượt là 1.0; 3.0; 5.0 mg/l.
Kết uả:
Từ kết quả ở bảng 3.12 và bảng 3.13 cho thấy nguồn gốc mẫu rễ có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả nhân rễ. Mẫu rễ trong bảng 3.12 có khả năng nhân rễ tốt hơn, cả nghiệm thức đều ra rễ, tỷ lệ ra rễ cao nhất là 0 %, số rễ thứ cấp cao nhất là 9 rễ/ mẫu. Mẫu rễ trong bảng 3.13 có tỷ lệ ra rễ cao nhất là 0 %, số rễ thứ cấp cao nhất là rễ/ mẫu, có trên nghiệm thức ra rễ nhưng những mẫu này lại được cấy trên môi trường chứa .
hi xét đến ảnh hưởng của loại auxin, ta thấy rằng phù hợp hơn với quá trình nhân rễ bất định của Sâm gọc inh. nồng độ 5.0 mg/l A kích thích nhân rễ tốt nhất (60 %), có số rễ thứ cấp nhiều nhất (9 rễ/ mẫu) và mẫu tăng trọng cao (Trọng lượng tươi trung bình là 90 ± 0 mg/l, tăng .5 lần so với ban đầu). ơn nữa, có tới 5/ nghiệm thức bổ sung cho kết quả ra rễ so với IB chỉ có / nghiệm thức. Vậy giữa IB và , ở nồng độ .0 mg/l phù hợp cho việc khơi tạo rễ từ mô sẹo và ở nồng độ 5.0 mg/l phù hợp hơn cho quá trình nhân rễ bất định Sâm gọc inh.
Bảng 3.12: nh h ởng của IBA và NAA đến khả năng nhân r của mẫu có nguồn gốc từ môi tr ng bổ ung NAA:
NAA (mg/l)
IBA (mg/l)
Tỷ ệ ra r (%)
ố r thứ cấ
Trọng ng t i trung bình
(mg/l)
1 - 20 1 140 ± 10
3 - 30 4 290 ± 10
5 - 60 9 390 ± 20
- 1 10 1 450 ± 50
- 3 20 2 330 ± 20
- 5 30 1 280 ± 30
Bảng 3.13: nh h ởng của IBA và NAA đến khả năng nhân r của mẫu có nguồn gốc từ môi tr ng bổ ung IBA:
NAA (mg/l)
IBA (mg/l)
Tỷ ệ ra r (%)
ố r thứ cấ
Trọng ng t i trung bình
(mg/l)
1 - 40 3 350 ± 10
3 - 20 1 180 ± 30
5 - 0 0
- 1 10 1 270 ± 10
- 3 0 0
- 5 0 0